蛋白质的显色反应.docx

蛋白质的显色反应 实验二蛋白质的显色反应 一、 实验目的 1、 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接 形式。 2、 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3、 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、 呈色反应 1、双缩脲反应 （1）原理: 尿素加热至180°C左右，生成双缩脲并放出一分 子氨。双缩脲在碱性条件下能与 cu+结合生成紫红 色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中 有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二 肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。可用于蛋白质 的定性或定量测定。 反应式如下： NH2 / NH2 180 oC 双缩脲 NH + NH3 紫红色化介物 双缩服反应不仅为含有两个以上肽键的 物质所有，含有一个肽键和一个-cs-nh 物质所有，含有一个肽键和一个-cs-nh2, -ch2-nh2, -chr-nh2, -ch2-nh2-ch-nh2-ch2-oh 或-chohch2nh2 等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。 NHs也干扰此反应，因为旧3与cf可生成暗蓝色的 络离子Cu 络离子Cu (NH3) 42+o因此，一切蛋白质或二肽以上 的多肽都有双缩腮反应，但有双缩服反应的物质不 一定都是蛋白质或多肽。 （2）试剂 ①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液, ④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水二1： 9） （3）操作 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热 使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热， 尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10%氢氧化钠 溶液约1mL振荡混匀，再加1漏酸铜溶液1滴， 再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫 酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 （由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红 色） 向另一试管加2%^清蛋白溶液（改为蛋清溶液： 水=1 : 9）约1mL和10瘪氧化钠溶液约2mL摇 匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫 瑰色的出现。 2、茚三酮反应 （1）原理 蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有：-氨基酸均 能发生该反应，除无a -氨基的脯氨酸和羟脯氨酸 呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生 成蓝色化合物。氨、（3 -丙氨酸和许多一级氨化合 物都有此反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上 O 的亚氨基不呈现此反应。。因此，虽然蛋白质或氨基 酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应 的不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱羧成 醛，放出CO、NH，水合茚三酮被还原成还原型茚 三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水 合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。 反应机理如下： 还原型茚三酮3HNH OH++3H N 还原型茚三酮 3 H N H O H + + 3 H N 还原型茚三酮 OIIOII+ 3H2O O II O II + 3H2O 该反应非常灵敏，1: 150万浓度的氨基酸水溶液 即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在， 另一方面要在适宜的 PH条件下进行测定。该反应 的适宜的PH为5?7，同一浓度的蛋白质或氨基酸 在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚 至不显色。 (2)试剂 ①蛋白质溶液： 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液 (蛋清：水=1: 9)，②0.5%甘氨酸，③0.1%茚三酮 水溶液，④0.1%茚三酮-乙醇溶液。 (3)操作 ①取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶 液1mL再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液，混匀，在 沸水浴中加热1?2分钟，观察颜色由粉色变紫色 再变蓝色(pH不同颜色深浅不同)。 ②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干 后，再在原处滴一滴 0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微 火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 3、黄色反应 (1)原理 含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸 后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中 进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下 HONaOH+ HNO 3 HO NaOH + HNO 3 n一 o- Na + 硝基酚（黄色） O 邻硝醌酸钠（橙黄色） 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄 色反应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才 有黄色反应。 （2）试剂 ①鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用 6层纱布过滤， 然后按鸡蛋清：水=1： 20配制而成。 ②大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成 浆状再用纱布过滤。 ③头发。④指甲。 ⑤0.5%苯 酚溶液。⑥浓硝酸。⑦0.3%色氨酸溶液。⑧0.3%酪 氨酸溶液。⑨10疱氧化钠溶液。 （3）操作 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管 出现的现象，有的试管反应慢可略