SP110在THP1巨噬细胞中过表达模型建立及功能学研究.pdf

摘要 目的:构建SP110 基因过表达的人单核巨噬细胞THP-1细胞模型，体外感染结核分枝杆菌 H37Ra。初步探讨SP110基因在巨噬细胞抗Mtb 感染中的作用机制。 方法：①利用PCR法获取SP110基因序列，构建慢病毒载体LV5-SP110，转化大肠杆菌， RNAi-Mate pGag/Pol pRev 双酶切及测序鉴定后，用 将重组质粒和慢病毒辅助质粒系统( 、 、 pVSV-G) 包装成重组慢病毒颗粒，共转染293T 细胞，获取慢病毒毒液并计算病毒滴度；② 用已知滴度的慢病毒毒液转染THP-1细胞，以空质粒LV5-NC转染组作为对照，计算转染效 率。采用RT-PCR法、Westernblotting 法鉴定SP110基因的表达；③MTT法检测SP110基因 过表达对巨噬细胞的生长状态的影响；嘌呤霉素筛选稳定高表达SP110基因及稳定表达 eGFP(绿色荧光)的THP-1细胞，分别作为实验组和对照组；用终浓度为200ng/mlPMA进行 H37Ra 24h 96h CFU 诱导分化后，体外感染 ，感染 、 后细胞裂解物细菌培养菌落计数( )的方法 观察实验组及对照组细胞抗H37Ra 的感染活性。 结果：1.双酶切鉴定及DNA 测序比对显示获得了与预期SP110基因序列完全一致的基因 片段(1650bp)，且成功构建了LV5-SP110和LV5-NC载体；经293T细胞包装后，成功获得 8 病毒滴度为 1×10 TU/ml 的重组慢病毒LV5-SP110和LV5-NC；2.成功转染了THP-1细胞， 转染效率为50%，经RT-PCR法、Westernblotting法鉴定,实验组细胞SP110基因在转录、翻 译水平高表达；3.MTT法未发现LV5-SP110对THP-1巨噬细胞有抑制生长的作用；经嘌呤 霉素筛选后获稳定高表达 SP110基因的THP-1细胞及稳定表达eGFP(绿色荧光蛋白)的细胞； 体外抗分枝杆菌H37Ra实验，显示SP110基因过表达的实验组巨噬细胞裂解物细菌培养菌落 CFU p 0.05 计数 （ ）低于对照组，差异具有统计学意义 （＜ ）。 结论：成功构建了SP110基因过表达模型；SP110基因的过表达对巨噬细胞的增殖无抑制 作用，体外抗菌实验表明SP110基因的过表达增强了巨噬细胞杀伤胞内吞噬的结核分枝杆菌 H37Ra 的能力。 关键词：SP110；慢病毒；结核杆菌 I ABSTRACT Objective:To construct a human mononuclear macrophage THP-1 cell model with overexpression of SP110 gene, to infect mycobacterium tuberculosis H37Ra in vitro, and preliminarily investigatethemechanism of SP110geneinmacrophageagainst Mtb infection. Methods:① The SP110 gene sequence was obtained by PCR, the lentiviral vector LV5-SP110 was constructed, and the recombinant plasmid and the lentivirus-assisted plasmid system (pGag/Pol pRev pvsv-g) were packaged into recombinant lentivirusparticles by RNAi-Mate after double enzyme digestion and sequencing identification.And the lentivirus venom was obta