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Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化 【目的要求】 1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。 2.熟悉盐析、离心、层析、电泳、比色等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。 4.学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案、技术路线和质量监控和保证措施。 【实验原理】 不同蛋白质的理化性质和生物学性质各有不同，利用这些不同便可获得分离纯化。 血清蛋白有300多种,可粗略分成清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡聚糖凝胶G—25（Sephadex—25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换柱，便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白，其反应机理如下：  被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。 纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。 【实验准备】 一、器材 1.离心机 2.层析柱(直径约1-1.2cm,长约30cm) 3.电泳仪 二、试剂 1.饱和(NH4)2SO4溶液 称固体(NH4)2SO4（分析纯）850g置于1,000ml蒸馏水中，在70～80℃水中搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和(NH4)2SO4液。 2.葡聚糖凝胶G—25按每100ml凝胶床需干的葡聚糖凝胶G—25 25g，置于锥形瓶中，按每克干胶加入蒸馏水约30ml，轻轻摇匀并于沸水浴中加热1小时，或于室温浸泡24小时，搅拌后稍静置，倾去上清细粒，用蒸馏水漂洗。 3.0.075mol/L pH6.3磷酸缓冲液(pH6.3 PBS) ⑴0.0175mol/L NaH2PO4液　秤取NaH2PO4 2H2O 2.730g溶于100ml蒸馏水中，转入1000cc容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度即成。 ⑵0.0175mol/L Na2HPO液　秤取Na2HPO4·12H2O 6.269g，如⑴配制即成。 取⑴液77.5ml、⑵液22.5ml，混匀后即成0.075mol/L pH6.3的磷酸缓冲液。 4.20%磺基水杨酸。 5.Nesseler试剂 6.血清醋酸纤维薄膜电泳实验的全套仪器及试剂。 7.DEAE（二乙氨基乙基）纤维素处理 按100ml柱床体积称取DEAE纤维素14g，每克加0.5mol HCl 15ml搅拌，放置30分钟（HCl处理时间不可太长，否则DEAE—纤维素变质），加约10倍量的蒸馏水搅匀，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液，如此反复2～3次，沉淀30分钟，虹吸吸去上清或布氏漏斗抽滤，如此水洗至清液pH>4为止。加等体积1mol NaOH，使最终浓度约为0.5mol NaOH，搅拌后，放置30分钟，以虹吸吸去上层液体，同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止，虹吸吸去上层液体，然后加入0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液使之平衡，置4℃冰箱内保存备用。 【实验操作】 1.(NH4)2SO4盐析 取血清2.0ml，缓慢滴入饱和（NH4）2SO4溶液2.0ml，边加边搅，混匀后于室温中放置10分钟，然后3000转离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液1ml，使之溶解，作为纯化γ球蛋白用。 2.凝胶层析脱盐 葡聚糖糖凝胶G—25层析柱的准备：取层析柱垂直夹于架上，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液，待底部凝胶沉积到1～2cm时，再打开出口，并用玻璃棒插入到凝胶床表面下，轻轻搅动，继续加入凝胶，待凝胶下沉至10～15cm高（防止凝胶分层和柱内混有气泡，使表面平整并盖一尼龙布或塑料片）。用0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液流洗平衡后，即可使用。 上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面（注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进入凝胶床）。关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢加到凝胶床表面上（注意不要将凝胶粒冲起或破坏凝胶床表面的平整）。开下端出口，使样品进入凝胶床后再加少量的缓冲液，如此重复三次，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后可加入适量的缓冲液洗脱。 加样开始后应立即收集洗脱液，流速约0.5ml/分钟，每2分钟收集一管。 洗脱液中蛋白质与NH+4的检查：取比色皿2个（一个为黑色背底，另一个为白色），按洗脱液的管号顺序分别取1滴，滴于比色皿中，前者各加20%磺基水杨酸2滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。于另一比色皿中各加入Nesseler试剂1滴，以观察NH+4出现的情况(若有棕黄色，即碘化双汞铵[NH2·Hg2I2]生成，说明有NH+4的存在)