医疗污水病毒检测样品制备过程中质量控制方法.pdf

附 录 A （规范性附录） 医疗污水病毒检测样品制备过程中质量控制方法 A.1 试剂和材料 A.1.1 所用试剂应使用分析纯试剂和无菌纯水。 A.1.2 磷酸盐缓冲液：参考 4.16 。 A.1.3 噬菌体 MS2 贮存液：ATCC 15597-B1 。效价不低于 1010 PFU/mL 的噬菌体 MS2 贮存液。 根据本附录 B.4 方法测定其实际效价。 A.1.4 噬菌体 MS2 工作液：根据噬菌体 MS2 贮存液实际效价，使用无菌磷酸盐缓冲液稀释 至 105 PFU/mL 。 A.1.5 宿主细菌 E.coli ：ATCC 15597 。噬菌体 MS2 宿主细菌， OD 600应介于 0.2和 0.4之间。 A.1.6 固体培养基平板制备：固体培养基 A 组分经 121 ℃灭菌 15 min 后，降温至 45 ℃ ～ 50 ℃，加入 50 mL 培养基 B组分，充分混匀后，逐个倾倒入直径为 150 mm的平板。凝固后置 于4 ℃保存，不超过 1周。 注 1： 固体培养基 A 组分：称取胰蛋白胨 10 g，氯化钠 8 g，酵母提取物 1 g，琼脂 15 g，加入 950 mL 纯水； 培养基 B组分： 称取葡萄糖 10 g，氯化钙 2.94 g，维生素 B 100 mg ，加入 500 mL 纯水。 完全溶解后， 采用孔径为 0.22 μm的针式过滤器过滤除菌，除菌后于 4 ℃保存，不超过 1周。 A.1.7 半固体培养基制备 ：半固体培养基 A 组分经 121 ℃灭菌 15 min后，置于 4 ℃保存，不 超过 1周。 注2 ：半固体培养基 A 组分：称取胰蛋白胨 10 g，氯化钠 8 g，酵母提取物 1 g，琼脂 5 g，加入 950 mL 纯水。 A.1.8 一次性针式过滤器：直径 25 mm ，孔径 0.22 μm。 A.2 仪器和设备 A.2.1 生化培养箱：培养温度可在 0 ℃~60 ℃范围内调节。 A.2.2 恒温水浴锅：温度可在室温 ~99 ℃范围内调节。 A.2.3 电子万用炉：功率为 1000 W 。 A.2.4 生物安全柜：安全等级 II 。 A.2.5 压力蒸汽灭菌器：灭菌温度可升至 121℃，压力可维持 0.1 MPa~0.15 MPa 。 A.3 质量控制样品的设置 A.3.1 实验中应设置空白样品、空白加标样品和基体加标样品。 A.3.2 每批样品应设置一个空白样品实验。采用 2 L 无菌磷酸盐缓冲溶液作为空白样品。 A.3.3 每批样品应设置一个空白加标样品实验。 采用 2 L 无菌磷酸盐缓冲溶液添加 1 mL噬菌 体MS2 工作液（ B.1.4 ）作为空白加标样品。 A.3.4 每批样品中设置基体加标样品数量不低于总样品的 10%，若样品数量不足 10个，应 至少设置一个基体加标样品实验。 采用 2 L 医疗污水样品添加 1 mL 噬菌体 MS2工作液 （B.1.4 ） 作为基体加标样品。 A.4 噬菌体 MS2 效价的测定 A.4.1 采用双层平板法测定噬菌体 MS2效价。 A.4.2 培养基准备 A.4.2.1 使用电炉加热半固体培养基 A组分至融化，降温至 45 ℃～ 50 ℃，与培养基 B组分 按照 950：50 的比例混合得到半固体培养基。将混合后的半固体培养基按需分装至无菌离心 管中，每管中加入 35 mL半固体培养基。分装后半固体培养基放入 45 ℃水浴锅中保持温度， 防止凝固。 A.4.2.2 取固体培养基平板， 将样品名称、 实验时间和实验人标记于平板背面， 倒置于 3