生活污水中噬菌体的分离及基因组研究.pdf

摘要 城市污水蕴藏着多种潜在的病原体，一旦进入动植物体中会造成各种疾病的 产生，而处理后的污水仍可能含有较高的微生物数量。噬菌体是感染细菌等微生 物的病毒，具有很强的宿主特异性和多样性。人们开始利用噬菌体的特性进行多 个领域的病原体控制研究。实验所需的样品来自北京排水集团清河再生水厂。经 过富集分离得到了 52 株细菌菌株，并以它们为宿主，特异性的分离得到了 3 株 噬菌体。对这些噬菌体的噬菌谱、效价、感染复数和生长曲线等生物学特性进行 分析，并利用透射电镜、全基因组测序、拼接和功能注释，对噬菌体基因组结构 进行初步探究。 本次实验共分离出了 52 株细菌，将分离纯化后的细菌进行 16S rRNA 测序 后，根据 NCBI 数据库的序列比对结果确定细菌种类。并以分离出的 52 株细菌 作为潜在宿主来分离噬菌体，最终分别通过 Raoultella ornithinolytica 、 Enterobacter kobei 和 Citrobacter freundii 3 株细菌分离得到了 3 株对应的噬菌体 LW03 、EK06 、NM19 。结果显示 3 株噬菌体噬菌体 LW03 、EK06 、NM19 均可 形成透明且边缘清晰的噬菌斑；电镜下观察到3 株噬菌体均有规则的正多面体头 部和明显的尾部。 LW03 属于长尾噬菌体科（Siphoviridae ）；EK06 和 NM19 均属于肌尾噬菌体科（Myoviridae ）。3 株噬菌体在本研究分离的细菌范围内均 具有宿主特异性。 对噬菌体进行基础生物学分析表明，EK06 的悬液的效价可达 1.03 ×1010 PFU/mL ，NM19 的悬液的效价可达 2.37 ×1010 PFU/mL ；EK06 的最佳感染复数 为 0.1 ，NM19 的最佳感染复数为 1。通过测定噬菌体的一步生长曲线我们发现， EK06 的潜伏期约为 50min，爆发期约为 50-70min；NM19 的潜伏期约为 30min， 爆发期约为 30-50min 。（3 ）通过基因组测序及分析，发现 LW03 基因组长度为 109430bp，共包含有 93 个开放读码框（ORF ）和24 个 tRNA ，其中 47 个 ORF 功能已知，46 个 ORF 为假想蛋白表达序列。EK06 基因组长度为 178140 bp ， 共包含有 270 个 ORF 和 1 个 tRNA 其中 110 个 ORF 功能已知，160 个 ORF 为假 想蛋白表达序列。NM19 基因组长度为 89089 bp，共包含 132 个 ORF 和 26 个 tRNA ，其中 32 个 ORF 功能已知，100 个 ORF 为假想蛋白表达序列。已赋予功 能的蛋白质编码序列（CDS ），可分为结构蛋白模块、DNA 包装模块、裂解模 块、DNA 重组复制模块以及假想蛋白模块等五大类；全基因组比对发现，LW03 与 Bacteriophage Eos 的同源性最高 （83.42%），可能属于长尾噬菌体科中的一个 属。EK06 与 Cronobacter phage vB_CsaM_GAP161 的同源性最高（98.28% ），可 能同属于肌尾噬菌体科 T4 样噬菌体属。NM19 与 Escherichia phage fjerdesal 的 同源性最高（88.84% ），所以NM19 可能同属于肌尾噬菌体科ΦH 样噬菌体属。 本研究从生活污水中分离了多株细菌菌株，在此基础上获得了 3 株噬菌体， 并对它们进行了系统的生物学鉴定和基因组学分析，在一定程度上积累和丰富了 微生物菌株资源，研究结果也可以为噬菌体及其裂解酶在环境微生物污染的消除 以及防控上提供一定的数据参考及理论依据。 关键词：污水处理厂，病原菌，噬菌体，生物学特征，基因组