实验二十二、影响酶促反应的因素.docVIP

实验二十二、 影响酶促反应的因素 ?1、目的要求? 通过本实验了解pH、温度、抑制剂对酶活力的影响。 2、实验原理? 酶作为生物催化剂与一般催化剂一样呈现温度效应，酶促反应开始时，反应速度随温度升高增快。达到最大反应速度时的温度称为某种酶的最适温度。由于绝大多数酶是有活性的蛋白质，当达到最适温度后，继续升高温度，引起蛋白质变性，酶促反应速度反而逐步下降，以致完全停止。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间长短有关。测定酶活性均在酶促反应最适温度下进行。大多数动物来源的酶最适温度为37－40℃，植物来源的酶最适温度为50－60℃。酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性, 酶活性最高时的pH, 称为酶的最适pH。高于或低于此pH时酶的活性逐渐降低。酶的最适pH不是一个特征物理常数，对于同一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。在酶促反应过程中，抑制剂对酶的抑制作用可分为可逆抑制和不可逆抑制。可逆抑制有根据抑制剂和底物的关系分为三种类型：竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制。。在本实验中，胰蛋白酶的最适温度为37℃，最适pH值为8.1。胰蛋白酶的抑制剂为苯甲脒，其抑制方式为竞争性抑制。 3、试剂和器材 一、试剂 5％三氯醋酸溶液。 1mmol/L苯甲脒溶液：称取19.25g苯甲脒，用少量水溶解，定容至100mL。 1%酪蛋白溶液：取1g酪蛋白，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液10mL、水40Ml, 置60℃水浴加热至溶解，放置室温后，加水稀释成100mL, 并调至pH 8.0。 0.1mol/L硼酸缓冲液： A液：0.1mol/L 硼酸(H3BO3) 称取6.18g H3BO3溶于1000mL水中。 B液：0.025mol/L 硼砂（Na2B4O7?10H2O） 称取9.54g硼砂（Na2B4O7?10H2O）溶于1000mL水中。 PH7.4硼酸缓冲液：90mL A液+10mL B液 PH8.0硼酸缓冲液：70mL A液+30mL B液 PH9.0硼酸缓冲液：20mL A液+80mL B液 二、材料 胰蛋白酶溶液：50－200μg/mL，用0.1 mol/L, pH8.0硼酸缓冲液配制。可用粗提的猪胰蛋白酶，用量根据实际测的比活值而定。 三、仪器 试管1.5×15cm（×19）；移液管1mL（×7），2mL（×3），5mL（×5）；量筒100mL（×1），恒温水浴；冰浴（0℃）；白瓷板；胶头滴管。 4、操作方法 一、温度对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作： 操作项目 管号 1 2 3 胰蛋白酶溶液(mL) 0.2 0.2 0.2 蒸馏水(mL) 0.8 0.8 0.8 温度预处理5min（℃） 0 37 70 1％酪蛋白溶液 1.0 1.0 1.0 混匀后，置各相应温度保温10min，加入3.0mL 5％三氯醋酸溶液终止反应。 A253 ? ? ? 空白管：先在试管中加入1.0mL1％酪蛋白溶液和3.0mL 5％三氯醋酸溶液,摇匀后，再加入0.2mL酶液, 0.8mL蒸馏水，在37℃保温10min。 将样品管和空白管分别离心，取上清液于280nm处测定各管的吸光值，并比较之。 二、pH对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作： 操作项目 管号 1 2 3 胰蛋白酶溶液(mL) 0.2 0.2 0.2 PH7.4硼酸缓冲液(mL) 0.8 0 0 PH8.0硼酸缓冲液(mL) 0 0.8 0 Ph9.0硼酸缓冲液(mL) 0 0 0.8 混匀，37℃水浴中保温2min 1％酪蛋白溶液(mL) 1.0 1.0 1.0 迅速混匀，37℃水浴中继续保温10min，加入3.0mL 5％三氯醋酸溶液终止反应。 A253 ? ? ? 空白管：先在试管中加入1.0mL1％酪蛋白溶液和3.0mL 5％三氯醋酸溶液,摇匀后，再加入0.2mL酶液, 0.8mL蒸馏水，在37℃保温10min。 将样品管和空白管分别离心，取上清液于280nm处测定各管的吸光值，并比较之。 三、抑制剂对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作： 操作项目 管号 1 2 1％酪蛋白溶液(mL) 1.0 1.0 1mmol/L苯甲脒溶液(mL) 0 0.1 蒸馏水(mL) 0.8 0.7 混匀，37℃水浴中保温2min 胰蛋白酶溶液(mL) 0.2 0.2 迅速混匀，37℃水浴中继续保温2min，加入3.0mL 5％三氯醋酸溶液终止反应。 A253 ? ? 空白管：先在试管中加入1.0mL1％酪蛋白溶液和3.0mL 5％三氯醋酸溶液,摇匀后，再加入0.2mL酶液, 0.8mL蒸馏水，在37℃保温10min。 将样品管和空白管分别离心，取上清液于280nm处测定各管的吸光值，并比较之。 5、注意事项 （1）由于胰蛋白酶活力不同，