基因工程第三章2-Jun-finalversion.pptxVIP

Cloning Vectors;第三章??基因克隆载体;第二节? 噬菌体载体;一、噬菌体的一般生物学特性;噬菌体的结构;;烈性噬菌体 温和噬菌体 溶源化细菌 溶源化 原噬菌体;噬菌体的侵染与包装;二、λ噬菌体载体;λ噬菌体的电子显微镜照片; a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需DNA序列． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’ b) λ基因组DNA上有56种限制酶识别位点．;;λ噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和NCI基因， O-R 为裂解区. ;A：成熟包被，切开cos环， D,E：(占头蛋白75%) W,F：头尾连接 Int(整合),Xis(删除),Red促重组 N(早期调控)促O,P(复制).Red,Xis,Int转录和整合。 Q(晚期调控)促头,尾,S,R基因表达和溶菌 CI,CII,CIII为负调控，阻止溶菌;人为将λ噬菌体基因组分为3个区域： 左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。 中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和整合切割基因。 右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。;裂解周期 早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白的参与。 晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA线性排列的多聚体分子。 cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。;λ噬菌体DNA的复制;溶原性周期 λDNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。 cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。 附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现。 原噬菌体的删除作用 整合作用需要int基因的表达，???一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。 λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因的协同作用才能实现。;4. λ噬菌体的组装;1. 野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因 λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆位点。 包装限制: λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的75-105%，即39-52.5 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有与λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入22 Kb。;;2. λ噬菌体的改造;1) 除去多余的限制酶识别位点 天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。 一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。 自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。 ;通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的λ-噬菌体 ;2) 切除掉λDNA的非必需区 载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。 不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去 ;3) 引入无义突变 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型λDNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密