第09章基因工程和基因组学.pptx

第九章　基因工程 和基因组学1971年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年，Berg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 ? 得到新的DNA分子。1973年，美国斯坦福大学医学院的Cohen教授及其同事把抗四环素基因插入大肠杆菌质粒DNA后，组成一个重组DNA，结果发现这一个重组DNA能在大肠杆菌中复制,并具有抗四环素遗传表型。Stanley N. Cohen1974年,Cohen教授和加州大学的Boyer教授，将非洲蟾蜍的rRNA结构基因插入大肠杆菌质粒DNA，再转化入大肠杆菌，结果发现非洲蟾蜍的rRNA结构基因得到表达。上述实验说明，经DNA重组后的外源基因可在宿主体内成功表达。Herbert W. Boyer1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基 因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。20072008200919981999200020022006200119961997以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。第一节 基因工程一、基因工程概述:广义遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。 狭义遗传工程是指: 基因工程(重组DNA技术)。 １.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式,按照预先设计的蓝图，借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。 基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。2．基因工程操作过程：切接转增检3．内容：目的基因① 从细胞和组织中分离DNA；内切酶② 限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；载体③ 将酶切DNA分子与载体DNA连接?构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；重组DNA④ 把重组DNA分子引入宿主受体细胞?复制；⑤ 重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞 ?建立无性繁殖系(Clone)或发育成个体；⑥ 从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA 分子；转化与鉴定⑦ 使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质并分离、鉴定基因产物。表达二、基因的分离与鉴定一般而言，一个基因 ?是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。 ㈠ 从基因库中分离基因：1.构建基因库（library）基因库是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。① 核基因库： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所 有菌落。噬菌体或 (柯斯质粒)载体：重组DNA包装进噬 菌体，感染细菌， 收集噬菌斑。BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体) 载体：重组人工染色体，导入相应宿主细胞， 收集所有细胞，即为基因库。 ② 染色体基因库： 将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库?可选择特异基因以及分析染色体结构和组织。果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割，构建染色体区段基因文库。如对X染色体上多线染色体带的分析。人类基因组项目研究中， 利用流动细胞分离(flow cytometry)技术将人类染 色体分开，用于构建单 个染色体基因库，大大 加速了人类基因组作图 和分析。流式细胞分离原理酵母菌：利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electro–phoresis, PFGE)，将酵母菌16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。③ cDNA库：以mRNA为模板?经反转录酶合成互补DNA?构建 基因库。 真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T为引物与多聚A互补配对，在反转录酶的作用下，即可获得cDNA第一链。 真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列?得到的双链DNA分子经两端补齐后?以带有限制性酶切点的人工接头连