第六章 核酸扩增 学习小结.pdf

第六章 核酸扩增 一、学习目标 掌握 PCR 的概念、原理、体系组成、反应程序和结 果分析；PCR-FRLP 和逆转录 PCR、多重PCR、定量PCR 等 PCR 衍生技术的概念原理；实时荧光定量PCR 中引物和探 针的设计以及结果的分析。 熟悉 各类核酸扩增技术在临床分子生物学检验中的 应用。 了解 PCR-ASO 的概念原理。 二、重点和难点内容 （一）PCR （1）基本原理和过程：与细胞内DNA 的复制相似，由 变性、退火和延伸构成PCR 的一个循环，每一个循环完成 后，一个分子的模板双链DNA 被复制为两个分子。经过30 30 次循环的扩增，理论上即可得2 个拷贝产物。 （2）反应体系：主要包括模板、引物、dNTP、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等成份。 模板为要复制的核酸片段 （靶核酸），其来源可以是 基因组DNA、RNA、质粒DNA 或线粒体DNA 等。如果模板是 RNA，需要先逆转录成cDNA，然后以cDNA 作为扩增的模板。 模板DNA 的纯度、结构和数量是影响PCR 的重要因素。 引物为化学合成的两条寡核苷酸，决定PCR 产物的特 异性。引物的设计是获得良好扩增反应的先决条件和重要 步骤。设计引物时应遵循有关原则：引物的长度一般为20～ 30nt；二条引物自身或引物之间 （尤其在3-OH 末端）一 般不应存在互补序列；引物的四种碱基应随机分布、组成 平衡、C+G 碱基含量在引物中的比例一般为40%～60%；二 条引物的Tm 值不能差别太大；引物的3端应与模板严格 配对、避免重复的CG 碱基序列、最后一个碱基最好不落在 密码子的第三个碱基、尽可能选择A 或T 而非G 或C；引 物的5´ 端可加修饰成份。 反应体系中四种核苷酸的浓度必须一致。 DNA 聚合酶为耐热 Taq DNA 聚合酶，无校正功能，会 导致PCR 产物的序列发生错误。 缓冲液中盐离子影响DNA 变性和退火温度以及酶活性。 （3）反应程序：变性温度一般为 95℃～97℃，退火 温度取决于引物的Tm，通常低于引物Tm 5℃左右，延伸温 度为72℃。每个步骤的时间取决于所扩增片段的长度。循 环次数一般为20～40 次。 （二）PCR 产物分析 主要有PCR-RFLP、PCR-ASO、PCR-SSCP 等，用于分析 PCR 产物有无点突变。 （三）PCR 衍生技术 （1）逆转录PCR 是以细胞内总RNA 或mRNA 为材料进 行核酸扩增的技术。首先在逆转录酶的作用下，将 RNA 进 行逆转录反应生成cDNA，然后再以cDNA 作为模板进行PCR 扩增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR 在临床上主要用 于 RNA 病毒的检测，此外还被广泛用于 cDNA 克隆、cDNA 探针合成及基因表达分析等。 （2）多重 PCR 是在同一反应体系中加入多对引物， 同时扩增一份DNA 样品中同一靶DNA 或不同靶DNA 的多个 不同序列片段。临床上常用于分型或鉴定，如个体识别、 病原体分型或法学鉴定。 此外还有巢式PCR、转录依赖扩增系统、序列特异PCR、 任意引物PCR （随机扩增多态性DNA）、全基因组扩增、微 乳液扩增和锚定扩增、长片段PCR 等靶序列扩增技术。 （3）实时荧光定量 PCR 指在 PCR 反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 反应进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. 概念： 荧光阈值（threshold） 指在荧光扩增曲线上人为设 定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上。一 般来说，将 PCR 反应前 15 个循环的荧光信号作为荧光本 底信号，因此，荧光域值一般设置为 3～15 个循环的荧光 信号标准差的10 倍，但在实际应用时需结合PCR 反应扩增 效率、线性回归系数等参数来综合考虑。 循环数（cycle threshold value, Ct） 指PCR 扩增 过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的 循环次数。 2. 数据分析 1） 标准曲线法的