医疗药品管理基因工程药物研发的基本过程.pdfVIP

（医疗药品管理）基因工程 药物研发的基本过程 基因工程药物研发的基本过程 基因工程药物的研发分为上游和下游俩个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞) 。目的基因获得 后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是 保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶 段的工作主要于实验室内完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养壹直到产品的分离纯化和质量控制。 此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发 酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的 开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等 壹系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 血管抑制素(angiostatin,简称AGN)是纤溶酶原 的壹个酶解片段,相当于其 1～4Kringle 区,具有抑 制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿 瘤生长和转移的生物功能,是壹种新型血管生成抑 制因子[1,2],对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消 化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研 究价值和应用前景. PCR 产物的 T 载体克隆 （壹）重组T 质粒的构建 壹．原理 外源 DNA 和载体分子的连接就是 DNA 重组，这样重新组合的DNA 叫做重组体或重组子。重组 的DNA 分子是于 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+ 、ATP 存于的连接缓冲系统中，将分别经酶切 的载体分子和外源DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有俩种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。俩种 DNA 连接酶均有将俩个带有相同粘性末端的 DNA 分子连于壹起的功能，而 且 T4 噬菌体 DNA 连接酶仍有壹种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性，即能使俩个平末端的双 链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，壹般可通过提高 T4 噬菌 体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3 步：首先，T4DNA 连接酶和辅因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复 合物再结合到具有 5’磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺苷化；最后产生壹个新的 磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将俩个不同大小的片断相连。因为 DNA 片断有俩 个端点，所以切割时出现俩种可能，壹种是单酶切，另壹种是双酶切，这俩种酶切方法于基 因工程操作中均经常用到。对于单酶切来说，载体和供体的末端均相同，连接能够于任何末 端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行 5’ 除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA 片断的 3’OH 末端和 5’端，所以除磷后载体不会 自环。壹旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能和载体进行连接。通过这种方法 可大大减少由载体的自 环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体和供体同壹片段上均有不同的末端，这样就避 免了载体和供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另壹个特点是能将供体分子 定向连接到载体上。 连接反应的温度于 37℃时有利于连接酶的活性。可是于这个温度下粘末端的氢键结合是不稳 定的。因此采取折中的温度，即 12-16℃，连接 12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥 连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。TaqDNA 酶扩增的 PCR 产物，其 DNA 双链前后 末端均有壹个游离的 A 碱基，能够和 pGEM-TEasyVector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重 组T 质粒。 二．材料和方法 1 材料 外源 DNA 片断 2 仪器、用具 移液枪、碎冰 3 试剂 pMD18-TVector ；Ligationbuffer ；T4ligatease ；rATP 4 方法 连接体系如下： 16℃连接过夜。 （二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 1 材料 E.coliJM109 菌株 2 仪器、用具 超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电 泳槽、凝胶样品梳、移液器 3 试剂 (1)CaCl2 、LB 平板（见附录）；SOC 培养基（见附录）；SOB 培养基 (2)RNaseA1 ；BufferS1 ；BufferS2 ；BufferS3 ；BufferW1 ；无水乙醇的BufferW2a (3)1×电泳缓冲液（TAE ）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心] ；琼脂糖；6×加样缓冲液 (4)酚；氯仿；异