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2020-08-18 发布于浙江
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研究生专业技能训练.ppt

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RNA 提取及PT-PCR技术; ;mRNA;实验安排;实验一小鼠总RNA提取;注意事项;实验步骤;4. 4℃ 12000 rpm 离心15min，沉淀RNA，弃上清； 5. 用1 mL预冷的75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，12000 rpm 4℃离心10min，弃尽上清； 6. 重复步骤5，然后室温中自然干燥约10 min，至RNA呈半透明状即可 (用10μl枪小心吸取多余乙醇)； 7. 根据RNA提取量加20-100μL DEPC（50μL）处理的水溶解沉淀，56℃水浴 10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA溶液； 8. 如须保存，可加0.1体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.2倍体积的冰无水乙醇，充分??匀，于-70℃低温保存。或用稳定的甲酰胺溶（4mg/mL）, -20℃保存，用时，4倍乙醇沉淀，回收RNA。;RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定;RNA电泳（甲醛变性凝胶电泳）;用途: 检测细胞中基因表达水平检测基因表达细胞中RNA 病毒的含量直接克隆特定基因的cDNA 序列;适用于mRNA表达量解析 ? Two Step RT--PCR效率高 ? 使用Random和Oligo--dT 引物可以制备cDNA pool ? cDNA可长期保存;1.逆转录(RT); ;text1;;;;;;;;PCR产物生成曲线;;2.基因扩增（β-actin）;PCR具有极高的灵敏度;text1;;;;SYBR green 的优缺点;② TaqMan体系;TaqMan系统的一个例子;Taqman的优缺点 ;