缺氧下软骨细胞失分化过程中胶原蛋白脯氨酰4-羟酶的作用研究.pdf

目 录 摘要I Abstract III 常用缩写词中英文对照表 V 前 言 1 第一部分 氯化钴培养下软骨细胞的改变并筛选最佳浓度氯化钴缺氧诱导模型 2 1 材料与方法 2 1.1 一般材料 2 1.2 实验方法 3 1.3 统计学方法 6 2 结果 6 2. 1 使用阿利新蓝染色鉴定小鼠肋软骨细胞 6 2.2 不同浓度氯化钴培养下小鼠肋软骨细胞的形态改变 6 2.3 CCK8 法检测不同浓度氯化钴培养下小鼠肋软骨细胞增值率 7 2.4 细胞计数测定不同浓度氯化钴培养下可收集小鼠肋软骨细胞数 7 3 小结 7 4 第一部分实验附图 7 第二部分 缺氧下软骨细胞中胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶的改变及其作用研究 10 1 材料与方法 10 1.1 一般材料 10 1.2 实验方法 12 1.3 统计学方法 15 2 结果 15 2.1 缺氧下软骨细胞中C-P4Hs 及相关蛋白mRNA 表达变化 15 2.2 缺氧下软骨细胞中C-P4Hs 及相关蛋白表达变化并定位 16 2.3 蛋白质印迹法检测缺氧下软骨细胞中C-P4Hs 及相关蛋白表达变化 16 3 小结 16 4 第二部分实验附图 17 第三部分 传代中软骨细胞胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶的改变及缺氧的影响 2 1 1 材料与方法 2 1 1.1 一般材料 2 1 1.2 实验方法 23 1.3 统计学方法 24 2 结果 24 2.1 缺氧下不同代数可收集软骨细胞数及增值率改变并绘制细胞生长曲线 24 2.2 缺氧下不同代数软骨细胞中C-P4Hs 及相关蛋白mRNA 表达变化 24 2.3 缺氧下不同代数软骨细胞中C-P4Hs 及相关蛋白表达变化 25 3 小结 25 4 第三部分实验附图 25 讨论 28 结论 30 参考文献 31 综 述 33 致 谢 42 个人简介 43 山西医科大学硕士学位论文 缺氧下软骨细胞失分化过程中胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶的作用 研究 摘 要 目的： 观察缺氧对软骨细胞体外培养时的失分化过程的影响，并探究胶原蛋白脯氨酰4- 羟化酶 （C-P4Hs）和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在其中的作用。 方法： 将第 3 代小鼠肋软骨细胞分别在不同浓度Cocl 条件下组分别培养 72h，筛选最 2 佳浓度的Cocl 缺氧诱导模型。取第3 代小鼠肋软骨细胞分为：常氧组、缺氧组，分 2 别取第3 代肋软骨细胞于不同时间段（6、12、24、48、72 ｈ）及1、3、5、7 代肋软 骨细胞于 72h 使用CCK8 法及细胞计数仪测定细胞增殖率，使用荧光定量PCR、免疫 荧光染色、Western blot 检测各组HIF-1α、P4H α1、P4H α2 和Col-II 随培养时间 及代数的动态变化。 结果： 1. 软骨细胞分别在不同浓度Cocl 条件下分别培养72h 后，100 μM/L Cocl 组在培养 2 2 72h 时细胞增殖率最高，细胞呈典型的多角形和铺路石状；当Cocl 浓度150 μM/L 2 时，细胞增殖率(P0.05)显著降低。 2. 常氧与缺氧下诱导软骨细胞0-72h 后，RT-qPCR 结果显示缺氧组P4H α2 及Col-II mRNA 较常氧组表达显著升高 (P0.05)。免疫荧光结果显示HIF-1α与P4H α2 主 要累积于胞核内，