基础医学免疫学实验技术.pptxVIP

免疫学实验技术;抗体;多抗来源;;基本步骤;实验方法;实验方法;多抗的特点;什么情况下需要制备单克隆抗体;单抗制备原理;单抗制备原理;基本步骤;实验方法;阳性细胞筛选;杂交瘤细胞的冻存;单克隆抗体腹水制备及纯化;其他抗体纯化方法;盐析法（硫酸铵沉淀);正辛酸-硫酸铵沉淀法;离子交换法;亲和层析法;凝胶过滤法(分子筛);纯化方法选择原则;腹水效价测定;单抗与多抗比较;酶联免疫吸附试验（ELISA） 蛋白免疫印迹（Western blot） 免疫荧光技术（IF） 免疫共沉淀（Co-IP) 染色质免疫共沉淀（Ch-IP) ;ELISA基本原理;;常用ELISA方法;基本步骤;基本步骤;;;;;;对照设定;ELISA的应用;免疫印迹（western blot）;基本原理;应用范围;6.最后加上相应的底物溶液，当二抗上的酶催化底物产生化学发光时,用X光片曝光，洗片后就会产生可见的区带，指示目的蛋白质的位置和强弱。 ;细胞总蛋白的提取;注意事项：; Western Blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组 之间总蛋白量基本一致;;目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。;SDS电泳;SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度 ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%)　　　　　线性分离范围／KDa 　　 15　　　　　　　　　　　 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212 ; 1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性???并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故???量或配胶时应戴手套及口罩 2.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 3.溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中 4.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4×蛋白质电泳上样缓冲液 5.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下方向电泳 6.电泳尽量在4℃冰箱中进行 ;转膜;;1.转膜液最好现配现用 2.检查样品凝胶是否与转移槽的 “-”侧保持一致 ，以确保样品蛋白由凝胶转移至膜上 。 3.NC膜应小心操作，防止破裂;转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。 ;DAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物 ，从而指示目的蛋白位置及强弱。 ECL发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，灵敏度高(一般可达到pg级以上 )等优点，且DAB具有致癌性。 应用化学发光，膜可以再生检测其他蛋白。 ; 1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉 （否则导致背景增高） 2.选择合适的一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会导致背景变黑） 3.选择合适的封闭液 （如果膜需要再生，最好选用脱脂奶粉，而非BSA） 4.应考虑ＥＣＬ试剂的发光强度及其衰灭时间，来选择合适的曝光时间 ; 一、膜上没有信号答：原因有很多：1 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程冰上操作；3 转膜过程出现失误；4 抗体或酶失活，选择在有效期内的试剂；5 抗体不能识别目的蛋白，多看看说明，看该抗体是否适用于western。;二、目的带很弱答：1 标本中靶蛋白含量低，可以加大样品的上样量。2 转膜不充分，可以通过提高转膜电流或延长转膜时间来解决。3 抗体效价低，可以减少抗体的稀释倍数，增加抗体浓度。 三、胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：1 膜没有均匀浸湿，PVDF膜转膜前应该用100%甲醇将膜完全浸湿10秒，快速激活；2