X7-2020 犬细小病毒微滴式数字PCR检测方法.pdfVIP

ICS 11.220 B 4 1 团 体 MA标 准 T/CVMA X7—2020 犬细小病毒微滴式数字PCR 检测方法 Method Of Droplet Digital PCR For Detection Of Canine Parovirus 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA X7—2020 前 言 本标准按 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 1 T/CVMA X7—2020 犬细小病毒微滴式数字PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了犬细小病毒（Canine Parovirus，CPV ）微滴式数字PCR检测方法的原理、试剂与耗材、 仪器与设备、操作步骤、结果分析。 本标准适用于犬细小病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 微滴式数字PCR （Droplet Digital PCR ，ddPCR ）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成 数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR 的一次检测变成数万次检测，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上 进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光 信号的微滴判读为0 。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 4 试剂与耗材 4.1 提取试剂 宜选取商品化的病毒DNA提取试剂盒。 4.2 微滴式数字PCR 扩增试剂 2 T/CVMA X7—2020 宜按照不同的微滴式数字PCR 平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR 扩增试剂。 4.3 引物和探针 CPV 上游引物 （CPV F ）：5’-TGGAACTAGTGGCACACCDA-3’ CPV 下游引物 （CPV R ）：5’-AAATGGTGGTAAGCCCAATG-3’ CPV 探针 （CPV P ）：5’-FAM-CAGGTGATGAATTTGCTACAGG-BHQ-3’ 。 5 仪器与设备 生物安全柜、PCR扩增仪、数字PCR微滴发生器、数字PCR微滴检测器、纯水仪、核酸定量仪、涡 旋震荡仪。 6 操作步骤 6.1 样品采集及运输 按照NY/T 541执行。 6.2 DNA 提取 按照所选取的病毒DNA提取试剂盒说明书进行提取。 6.3 微滴式数字PCR 扩增方法 每个样品微滴式数字PCR 扩增设置3 个平行。微滴式数字PCR 扩增体系配制如表1。该步骤按照 不同微滴式数字PCR 平台的说明书进行操作。 表1 微滴式数字PCR 扩增体系 试剂 终浓度 体积 ddPC