X4-2020 猫杯状病毒微滴式数字RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 MA T/CVMA X4—2020 猫杯状病毒微滴式数字RT-PCR 检测方法 Method of droplet digital RT-PCR For detection of feline calicivirus 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA X4—2020 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 1 T/CVMA X4—2020 猫杯状病毒微滴式数字RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猫杯状病毒 （Feline Calicivirus, FCV ）微滴式数字RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于猫杯状病毒检测的微滴数字RT-PCR法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字RT-PCR ：数字反转录聚合酶链反应（digital reverse transcript polymerase chain reaction ） FAM 羧基荧光素 （carboxyfluorescein ） MGB 小沟结合分子 （Minor Groove Binder ） RNA 核糖核酸 （ribonucleic acid ） 4 原理 微滴式数字PCR （Droplet Digital PCR ，ddPCR ）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成 数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR 的一次检测变成数万次检测，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上 进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光 信号的微滴判读为0 。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 本标准通过特异性引物和探针进行数字RT-PCR扩增，从而对猫杯状病毒进行快速检测。 5 试剂和材料 5.1 引物 上游引物：5 ＇- CCGTTAAYTCRGTGTTTGATTTG-3 ＇ 下游引物：5 ＇- GGCTCTGATDGCTTGAAACTG-3 ＇ 2 T/CVMA X4—2020 5.2 探针 探针：5 ＇-FAM-CCTGGGCTCTTCGCCGTCACC-MGB-3 ＇ 5.3 试剂 5.3.1 实验室用水：应符合GB/T 6682 中一级水的规格。 5.3.2 核酸提取试剂：推荐针对提取病毒RNA 的提取试剂盒。 5.3.3 数字RT-PCR 反应试剂盒：推荐按照不同的数字PCR 平台的说明书选取其推荐的数字RT-PCR 反应试剂盒。 6 仪器和设备 6.1 生物安全柜