动植物细胞器离法分离.pptVIP

实验4动植物细胞器分离、制备与观察 Ⅰ线粒体制备与活性鉴定 【目的】 1.掌握分离制备动物和植物细胞线粒体的方法 2.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 【原理】 ■线粒体( mitochondria)是真核细胞特有的, 冋能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物 质 脂肪、糖、部分氨基酸在此迸行最终的 氧化,并通过藕联磷酸化生成ATP,供给细胞 生理活动之需。 将动植物组织制成匀浆,在适当的悬浮介质中 用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的 离心场中(选用离心机的一定转速),球心颗粒 的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质 的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间 组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉 降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增 加离心力和离心时间,就能够使这些颗粒按其 收集,细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、 溶酶体和萁他微体、核糖体和大分子。 ■悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液,它 较接近细胞质的分散相,在一定程度上 能保持细胞器的结构和酶的活性;pH72 的条件下;亚细胞组分不容易重新聚集 成团,有利于分离。整个操作过程样品 要保持在0°C~4℃C,避免酶失活。 ■细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜 组分和分离纯度的主要依据,如线粒体 内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶使 詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿 色从而使线粒体显色,而胞质中的染料 被还原成