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慢病毒（过表达）包装步骤 秦超 转染 复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤：（以10cm培养皿为例） = 1 \* GB2 ⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。 = 2 \* GB2 ⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀 = 3 \* GB2 ⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min = 4 \* GB2 ⑷将 = 3 \* GB2 ⑶所得的转染试剂稀释液滴加到 = 2 \* GB2 ⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min = 5 \* GB2 ⑸取出细胞培养皿，将 = 4 \* GB2 ⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。 收毒(36-48h) 收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。 = 1 \* GB2 ⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。 = 2 \* GB2 ⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。 = 3 \* GB2 ⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。 接毒 接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。 检测及培养细胞系(48h) 如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。