多重链置换扩增技术的优化及其在单细胞中的应用.pdf

中文摘要 中文摘要 论文题目：多重链置换扩增技术的优化及其在单细胞中的应用 硕士研究生： 杨芳 导师姓名： 涂景 副教授 学校名称：东南大学 多重链置换扩增技术（MDA ）是目前使用较为广泛的全基因组扩增技术，使用具有保真性高、 持续合成能力强的phi29 DNA 聚合酶和6N 随机引物，可用于低起始量基因组DNA 或单细胞样本 的扩增，具有较高的扩增效率和均一性等优点。同时，MDA 反应在常温下进行，操作简单、方便。 由于具有上述技术优势，MDA 技术在分子生物学的各个领域都有广泛应用，包括个体医疗、法医诊 断、考古学和肿瘤的早期诊断等。根据目前的研究结果，MDA 扩增反应效果受多种因素影响，包括： 核酸模板起始量、缓冲液中Mg2+浓度、反应温度和反应时间等。为进一步加深对MDA 反应的认识， 优化反应参数，本论文针对可能影响 MDA 扩增反应效果的诸多因素分别展开研究，比较了不同参 数条件下的扩增效果，并在此基础上发展了用于单细胞全基因组扩增的MDA 反应体系及技术流程， 论文主要的研究内容如下： 1. 在MDA 扩增技术相关研究进展综述的基础上，选择核酸模板起始量、缓冲液中Mg2+浓度、 反应温度和反应时间等四个参数作为研究对象，对不同参数条件下的 MDA 扩增效果进行比较和分 析，绘制扩增效率曲线。结果表明：核酸模板的起始量对MDA 反应的最终扩增产物量影响较小，6- 600pg 的核酸模板均可以扩增产生600 ng/μL 左右的扩增产物；不同的Mg2+浓度对扩增产物量影响 较大，Mg2+ 的浓度在10-15mmol/L MDA 反应扩增效率最高；扩增反应的时间对扩增产量有一定的影 响，基于标准扩增体系，当反应时间不足8h 时，扩增产物量持续增长，8h 时达到平台，其后产量不 再随扩增时间的增加而提高；反应温度对MDA 的扩增产量影响较大，当温度低于20℃或高于40℃ 时，扩增反应几乎无法进行，温度在 25-35℃之间时，扩增反应可以进行，其中 30℃时扩增效率最 高，进一步高通量测序分析表明温度在30-35℃之间扩增一致性最高。 2. 在完成不同扩增参数的比较后，本论文优选了扩增产量高、扩增一致性高的参数，优化发 展了用于单细胞样本处理的全基因组扩增流程。单细胞全基因组扩增流程包括：单细胞的获取、细 胞裂解与中和、MDA 扩增。论文以YH-1 细胞系单细胞为研究对象，采用看家基因扩增的方式评价 扩增产物基因组的完整性，基于变异系数分析和测序效率分析评价 MDA 的扩增效果。结果表明： 本论文构建的单细胞全基因组扩增流程可有效实现单个细胞的全基因组扩增，重复性好，扩增产物 可覆盖40%左右的基因组，相关技术参数与目前已报道的单细胞基因组测序研究的水平相当。 关键词：多重链置换扩增技术，高通量测序技术，扩增一致性，单细胞扩增， 看家基因 I Abstract Abstract Title：Optimization of multiple displacement amplification and its application in single cell Graduate Name： Fang Yang Supervisor： Associate professor Jing Tu Name of the University ：Southeast University Multiple displacement amplification (MDA) is a widely used whole-genome amplification method, which has been used in various fields, including individual medical treatment, early diagnosis of tumor, archeology research, forensic testing and so on. This m