临床微生物检验技术 第三节 细菌生化鉴定技术 第三节细菌生化鉴定技术.ppt

第三节 细菌生化鉴定技术 　　 不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌 （一）糖类发酵试验 (1)原理：细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。多糖－→单糖－→丙酮酸－→酸性产物(或产酸产气)－→pH↓ －→指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现) (2)培养基：在培养基中加入0.5％-1％的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等) 糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管 试剂：酚红、溴甲酚紫等 (3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数小时至2w后，观察结果 (4)结果：分解糖产酸，呈酸性反应（变色），若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象;若不分解，除有细菌生长外，无任何变化 (5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要 （二）葡萄糖氧化/发酵（O/F）试验 (1)原理：细菌分解葡萄糖过程中，根据对O2需求的不同，分为 氧化型（只在有氧环境中分解葡萄糖） 发酵型（有氧、无氧都能分解葡萄糖） 产碱型（不能分解葡萄糖） (2)方法：将待检菌同时接种两支HL培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm。将培养基于35 ℃培养48h或更长。 (3)结果：两支培养基均无变化为产碱型；两支培养基均产酸（黄色）为发酵型；若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 (4)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别。也用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别－但配方不同。 Oxidation-Fermentation Test. （三）β-半乳糖苷酶（ONPG）试验 (1)原理：某些细菌产生β-半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚β-D-半乳糖苷ONPG，产生黄色邻-硝基酚 细菌分解乳糖需要2种酶： 半乳糖苷渗透酶（将乳糖送入细胞内） β-半乳糖苷酶（将乳糖分解为葡萄糖、半乳糖） 仅有β－半乳糖苷酶，则分解乳糖慢 ONPG结构与乳糖相似，但分子小，不需渗透酶可进入细胞 (2)方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37 ℃水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min左右观察结果。 (3)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。 (4)应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。 （四）七叶苷水解试验 (1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸的二价铁离子反应，生成黑色化合物。 (2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。 (3)方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。 (4)结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。 (5)应用：主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。 （五）甲基红试验 (1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解，产生甲酸等大量混合酸，使pH降至4.4以下，加入甲基红试剂呈红色。若分解葡萄糖产酸量少，则pH 在5.4以上，加入甲基红指示剂呈黄色。 (2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。 (3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2~4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。 (4)结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。 (5)应用：鉴别肠杆菌科细菌，尤其大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。 （六）V-P（伏－普）试验 (1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧氧化为二乙酰，二乙酰与胍基起作用生成红色化合物。 (2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。 (3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35 ℃培养48h后加入甲液(6％α·萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液)，振摇。 (4)结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35 ℃ 4h后仍不变色即为阴性。 (5)应用：鉴别肠杆菌科细菌，常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。 葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径 （一）吲哚/靛基质试验 ?原理:某些细菌含有色氨酸酶，分解色氨酸产生靛基质，靛基质与（对二甲基氨基苯甲醛）试剂反应形成玫瑰靛基质（红色） ?培养基：蛋白胨水培养基 ?结果：培养基液面红色为阳性 ?用途：鉴别肠杆菌科细菌 （二） H2S试验 原理：某些细菌分解含硫氨基酸而产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物 方法：穿刺接种醋酸铅或硫酸亚铁培养基，35 ℃