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人类细胞质RNA提取 RT-PCR的原理、方法 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 第六组 人类细胞质RNA提取 真核细胞质总RNA主要由rRNA(80 85%) tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA (1-5%) 组成,其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞 质中。 分离提纯A的目的 分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 A的不定性 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基, RNA 易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富,加热后仍能够正确折 叠恢复活 性,不易失活。 所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的 活性 RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上 的序列信息量的最大值。 (1)常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯(DEPC) 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。 它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪 处人伟白质亦 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制 剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既 可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又 对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成 的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质, 几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂( RNas in):从大鼠肝或人 胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNas in是RNA酶 的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合 ,使其失活。 (2)RNA提取的一般步骤 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤 RNA→融解RNA→保存RNA ①破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行 可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白 酶K等破碎组织 ●加入B-ME可以抑制RNA酶活性 分离RNA 半用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊 醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层 与 蛋白层分开 沉淀RNA 般用乙醇、3 M NaAc(pH-5.2)或异丙醇 ④洗涤RNA 使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉 此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤 千乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解 ⑤融解RNA 般使用TE ⑥保存RNA 应该尽量低温。为了防止痕量 RNase的污染,从 富含 RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的 RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于