Qubit4.0使用与维护SOP教学内容.docVIP

Qubit? 4.0荧光计的使用与维护标准操作规程 目的 检测核酸建库效果，作为核酸建库的质量控制措施。 适用范围 适用于检测核酸和蛋白的含量。 职能 用于建库及DNB制备相关的实验员检测核酸或蛋白质。 内容 4.1仪器型号 ThermoFish Qubit? 4.0 Fluorometer 4.2检测原理: Qubit? 4荧光仪定量检测核酸，其原理是基于特定荧光染料与所检测的核酸靶分子结合。这些荧光染料只有与这些靶分子结合时才会发射荧光信号，即使在浓度很低时。Qubit? 4.0荧光定量仪比传统的紫外吸光法更加准确。紫外吸光法不具有选择性，测量260nm所有分子的吸光值，包含DNA、RNA、蛋白质、游离核苷酸或多余的盐离子。此外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。使用 Qubit? 4荧光定量仪，将大大提升准确性。因为Qubit? 4分析试剂盒里的荧光染料只与样品中的特异分子结合——DNA、RNA或蛋白，避免不准确测量带来的重复工作。 4.3检测操作: 4.3.1使用要求： 请勿在阳光直射下操作仪器。 处理样品时戴无粉手套。 仅在室温（22-28 ℃）下使用仪器。 在室温下保存所有的试剂盒，仅在Qubit? 4荧光计测定荧光时才插入分析管。 在测量之前请勿用手握住分析管。 测量前仪器已经用适当的校准品校准过。 将样品或标准品与工作液混合之后，让Qubit?DNA和RNA分析管孵育2min。 将样品或标准品与工作液混合之后，让Qubit?蛋白分析管孵育15min。 如果要多次读取同一支管，请从仪器中取出分析管，让其平衡至室温30s，再进行下一次读取。 不建议多次读取RNA样本。 4.3.2配置工作液： （1）在主界面上选择试剂计算器计算出配置 Qubit?工作液所需的染料和缓冲液的量。 （2）输入将在Qubit? 4荧光仪上运行的样本数和标准品数量。可选：如果您想在计算的总容量中包含一个额外的管，请按下“超额”复选框。 （3）按Enter计算配置Qubit?工作液所需的Qubit?染料和缓冲液的量。注意：在此屏幕上可以更改计划检测的管数或超额选择。 （4）按Done返回主界面运行Qubit?检测。 4.3.3标准品校准： （1）从试剂盒里取出标准品standard1,2，在主界面选择要读取新标准的检测类型。要进入可用于检测的第二页，请将屏幕向右滑动。要返回第一页，将屏幕向左滑动。 （2）选择所需的检测方法 （3）点选试验，如果第一次选择会直接提示进行校准，如以前进行过校准，则会提示使用以前的或新进行校准。若要将先前的校正应用于样本读数，请按下“运行样本”。这里选择进行校准。 （4）出现下面界面，将试剂盒中用于校准的标准品1#放入样品室，点击“Read?standard”，大约3秒，读取完成进入到下一步，放入标准品2#，点击“Read?standard”（蛋白质校准还需放入标准品3#）。 （5）在读取标准品2#后（或读取标准品3#后），校准就完成了。如果校准成功,软件显示读取标准的屏幕,显示荧光与浓度图。 （6）荧光与浓度图:标准数据点被一条线连接。（圆圈表示正确的标准）如果校准失败，会显示“校准错误”，需重新进行校准。 （7）如果用于RNA IQ检测：检测成功，软件将显示准备好样本信息。如果校准失败,会显示“校准错误”。 （8）如果收到“校准错误”消息，需要重新运行校准。在弹出错误的屏幕中，按“OK”。查看Read标准屏幕。如果希望重新运行标准或运行新的标准，按Read标准，然后重复校准过程。 （9）检测RNA IQ，可以根据校准错误重新运行特定的校准。错误消息提供了如何纠正校准错误的指导。 4.3.4样品检测 （1） 将品与反应液混合（混合方案具体见试剂盒）孵化一段时间（DNA和RNA为2min,蛋白质需要15min）。 （2） 在Read standard（用于Qubit?定量分析）或Ready for samples界面，按Run samples。 （3）在样本量屏幕中，选择用于Qubit?定量分析或 Qubit? RNA IQ 检测的样本体积和单位。在方向盘上按+或-按钮选择检测管中样本体积（1-20ul），从下拉菜单中选择输出样本浓度的单位。在RNA IQ检测中，没有相关的单位，只选样本检测体积。 （4）将样品管插入到样品室，关上盖子，然后点击读取管。定量分析大约需要3秒，质量分析需要5秒。 （5）在屏幕上就会显示所检测的浓度。 多个样品检测： a. 相同体积和浓度单位：只需更换样本室中样本管，点击读取。 b. 不同体积和浓度单位，更改体积和浓度单位重复上述步骤。 4.3.5数据读取： （1）如果结果在检测范围内，则显示浓度值。顶部的数值（大体字）是原始浓度。底部的数