转基因植物遗传特性与表达调控.pptVIP

转基因植物的遗传特性与表达调控 钝交换 Cleavage cxchange 2异化  、转基因植物中外源DNA的整合特性 1、外源DNA的整合位点和拷贝数 (1)整合位点:转基因导入植物细胞后,通过细胞分裂时遗传物质的复 制过程整合到核基因组中,目前普遍认为,转基因在寄主染色体内的整合 位点是随机的,外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体,也可以 插入一条染色体的任何位点或没有固定的插入位点,但往往对转录活跃区 域具有优先插入特性 (2)整合拷贝数:许多研究表明,外源DNA的插入拷贝数有以下几种 贝单位点插入:串联多拷贝单位点插入;多拷贝多位点插入,多数情况 是以单拷贝在单位点整合,但在同一位点,也存在较多的多个拷贝串联整 合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接 转化整合拷贝数存在差异,前者拷贝数少,整合位点特异性强  2、外源DNA结构对整合的影响 外源DNA结构分为四种类型:单链线形DNA、单链环形DNA 双链线性DNA及双链环形DNA。四种结构中单链线状DNA研究较 多,一般认为单链DNA可以通过有效的不正常整合参与同源染色 体序列的重组,研究认为单链DNA在单链完全变成双链之前已发 生重组。此外 Bilang等(192)研究了导入烟草的DNA结构(线 形和环形)的重组效率,结果表明线性单链DNA同环形单链DNA 相比,其抗性愈伤组织数目要高于后者,说明线性DNA的整合效 率要高于环形DNA  3、转化后整合位点的DNA结构变化 保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件,外源 基因整合后的完整性与其结构变化有关,现已明确,外源基因作为侵入 者的整合,会引起不同程度的基因重排,涉及缺失、异位、倒位及重复 等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。 Mayerhofer等(1991)和 Gheysen等(1991)对15个独立的TDNA插 入进行了研究,提出了外源DNA整合模型, 他们认为: (1)TDNA的插入不会引起植物DNA大的重排,但在TDNA的两侧各出 现了一个158bp的正向重复序列,且多数插入会导致靶位点处小的缺失, 最多79个核苷酸 (2)在TDNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA, 这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似 (3)在靶位点处不要求有特异的序列,但若TDNA两端与植物靶位点之 间有一段短序列(5-10b)同源,则可能对TDNA整合进植物基因组其 作用。 此外,插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的,如油菜插入外源 DNA为5-6Kb,烟草中最大可达9Kb,但频率较低。  4、转化方法对整合外源基因结构的影响 尽管转化方法较多,但外源DNA以两种分子形式转化,一种是外源 DNA插入TDNA质粒载体中导入;另一种是裸露的DNA分子直接导入 由于转化原理不同,因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 (1)TDNA转化的外源DNA结构变化 农杆菌介导转化细胞中T-DNA结构完整,整合位点稳定,多数情况 下在25bp处与植物DNA连接,整合后的外源基因结构变异少,但外源 DNA会出现结构变化,表现为TDNA的串联和截短现象。 TDNA串联:通常有520个拷贝的TDNA的首尾相联,在大多数整合 事件中,TDNA可以在无选择压的情况下串联起来 TDNA截短:也是TDNA转化时较多发生的结构变化,可能是由于T DNA两侧各有一个25bp的边界类似序列。截短是在转移和整合过程中 产生,由于TDNA区内“框类似’序列的存在,被用作引导TDNA转 移和整合的次级识别位点,从而代替正常情况下的25bp右边界序列, 所以正常的有边界序列被截短 截短在共整合载体中比二元载体系统更易发生。  (2)裸露DNA直接转化的外源DNA结构变化 采用裸露DNA直接转化时,整合的外源DNA往往出现复杂的杂交 图谱,在转化当代及子代中常出现DNA环化、甲基化、片段分离和丢 失等现象 在DNA直接转化中供体DNA容易在整合过程中发生各种结构变化和 修饰,而且植物靶DNA序列也可在供体DNA整合过程中发生重排。  5、位点特异重组 (1)位点特异性重组系统 遗传重组分为3类:同源重组,转座和位点特异性重组,也称定位 重组。同源重组发生在两个具有一定程度同源性的DNA分子之间或同 子的两个同源性区域,它们相互重组。转座和位点特异重组的共 同点是重组只发生于具有特定的DNA序列的位置上,由特定的酶来识 别某一种DNA序列,而造成重排。二者的区别在于转座重组中,识别 位点之间的DNA片段被转位插入到另外的位点,