小鼠骨髓染色体制备及观察课堂.pptVIP

1 实验三 小白鼠骨髓染色体制备及观察 ? 1 、实验目的与要求 ? ⑴ 掌握动物骨髓细胞染色体制备技术 ? ⑵ 学会动物细胞的滴片方法 ? ⑶ 观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目 2 2 、实验原理 ? ⑴ 小鼠骨髓细胞 ? ⑵ 秋水仙素可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤 体的形成，把分裂细胞阻截在中期。 ? ⑶ 通过对小鼠骨髓细胞的低渗、固定、滴片、 染色等处理，可观察到小鼠染色体。 ? ⑷ 这种骨髓染色体制片方法简单，取材容易， 不需无菌条件，方便易行。 3 3 、实验材料 ? 实验动物 ? 健康小鼠 ( Mus musculus 2n=40) ，体重约 18 ～ 20g ，雌雄不限。 ? 试剂 ? 甲醇、冰乙酸、石炭酸品红、秋水仙素、 KCl 、 生理盐水 4 3 、实验材料 ? 实验器材 ? 恒温培养箱、普通离心机、显微镜、分析天平、 离心管 (5 ～ 10 mL) 、吸管注射器 (5 mL) 、 100 mL 烧杯、 ? 载玻片 （冰片） 5 3 、实验材料 ? 溶液配制： ? (1)0.01 ％秋水仙素：称 10 mg 秋水仙素，溶于 100 mL 生理盐水中。 ? (2) 低渗溶液：称 5.59 克 KCl 溶于 1,000 mL 蒸馏水 中，其浓度为 0.075M 。 ? 2% 柠檬酸钠溶液：：称 2.28 克柠檬酸钠溶于 100ml 蒸馏水中。 ? Giemsa 溶液 6 4 、实验方法 ? 主要实验步骤 ? ⑴ 秋水仙素注射 ? ⑵ 解剖小鼠 ? ⑶ 离心 ? ⑷ 低渗 ? ⑸ 固定 ? ⑹ 制备细胞悬浮液 ? ⑺ 滴片 ? ⑻ 空气干燥 ? ⑼ 染色 ? ⑽ 水洗 ? ⑾ 显微镜观察结果 7 方法与步骤 ? 取材前 3 ～ 4 h ，向腹 腔内注射秋水仙素。注 射浓度随动物种类不同 而异。秋水仙素的主要 作用是使分裂细胞阻断 在有丝分裂中期，增加 中期分裂相的比例。 8 腹腔内注射秋水仙素 3~4 小时后， 断头处死小鼠。 9 取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否 则容易造成骨髓细胞的流失。 10 滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、 肌肉等组织清除干净。 11 加入适量低渗液，用剪刀将骨充分剪碎，并 用吸管吹打，使骨髓细胞全部释放出来。 亦可用注射器抽取柠檬酸铵溶液冲洗骨髓，效果佳 12 将获得的液体收集到离心管中，离心后去上清液， 加低渗液至 8ml 左右，室温下静置 20~30 分钟，进行 低渗。低渗结束后，加入 1ml 左右的 Carnoys 固定液 进行预固定，轻轻混匀后，离心。 13 1000 转 / 分，离心 10 分钟，弃上清，加入固定液， 混匀后，室温放置 25 分钟，再次离心去上清，重 复固定一次，离心后，向沉淀中加入 1ml 固定液， 将细胞重悬。 14 预冷的玻片 15 滴片后，将片子晾干，滴加适量 Giemsa 染液染色 10~15 分钟，弃去染液，水洗，镜检。 16 实验结果 苯酚品红染色效果 17 结果显示 在显微镜寻找分散良好的 中期分裂相。小白鼠染色 体一般呈“ U” 形，都为近 端着丝粒染色体。染色体 数 2n=40 。 图示为吉姆萨染色效果