细胞衰老检查的实验关键技术及原理.doc

细胞衰老检验试验技术及原理（一） 关键词：细胞 色素 成纤维细胞 酶 磷酸 试剂 标准物质 北京标准物质网 衰老 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞形态改变关键表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、染色质固缩、胞内 \o 氢离子转运ATP酶溶酶体辅助蛋白2(ATP6AP2)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法) 溶酶体变多等。衰老 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞中细胞器数量特别是线粒体数量降低，胞质内有 \o 食用合成色素柠檬黄溶液标准物质 色素堆积和空泡形成，最终造成 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞死亡。总体来说衰老细胞多种结构呈退行性改变。依据其特征，现在常见于 \o 食品检测用亚硝酸钠溶液标准物质 检测衰老方法以下： 一、β-半乳糖苷酶活性 1995年，Dimiri等发觉体外培养二倍体 \o 碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法) 成纤维细胞在培养基pH值为6时，其β-半乳糖苷酶染色阳性率随代龄增加而逐渐上调，她们把这种中性β-半乳糖苷酶定义为SA-β-gal，即衰老相关β-半乳糖苷酶。衰老 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞或组织产生β-半乳糖苷 \o 肌酸激酶/肌酸激酶同工酶质控品(CK/CKMB) 酶能够催化底物X—Gal，生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很轻易观察到(图5-5-1)。在人体表皮角质层 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞中，也能够发觉SA-β-gal随年龄增加而增加。而且，SA-β-gal不依靠于DNA复制，能够区分衰老 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞和静止期细胞。 SA-β-gal是一种体内体外全部适用检测衰老生物标识物。因为检测SA-β-gal方法简单易行，其在检测衰老细胞方面有很广泛应用，现在已经有2400多篇论文应用了这种方法。 二、端粒长度检验 端粒是在真核细胞染色体末端顶部核蛋白结构，由高度保守TTAGGG反复序列组成，其存在能够保护染色体末端，是维持染色体稳定关键原因。鉴于端粒特殊结构，端粒长度会伴随每次细胞分裂而缩短，所以，端粒长度是衰老一个关键生物标志。这里我们关键讨论端粒限制性片段(TRF)分析及荧光原位杂交(FISH)法。 端粒限制性片段分析：TRF分析也称作端粒Southern印迹法，是应用针对端粒反复序列探针来检测限制性酶切后所保留端粒方法。限制性酶会将基因组DNA消化为短片段，留下大量完好端粒，即所谓端粒限制性片段。以凝胶电泳分离基因组片段，经过放射性探针(CCCTAA)。杂交“TTAGGG”反复序列方法能够检测到端粒存在。鉴于细胞异质性，TRFs大小不一，反应出细胞中端粒长度差别。TRF分析对试剂和仪器无特殊要求，所以这种方法现在有着较为广泛应用，但它存在某些缺点，TRF分析测量是整个样品端粒长度平均值，因为差别端粒长度相差很大，这种方法既不能分辨单个端粒也不能分辨单个细胞内端粒平均长度。鉴于短端粒在电泳迁移中不集中且杂交信号弱，这种方法极难检测到在衰老研究中尤为关键短端粒。此外，这种方法还存在操作复杂，所需样品量大等缺点。相比之下，FISH技术样品用量小、直观、敏感，能够检测染色体问端粒长度改变。 \o 硫酸奎宁荧光标准物质 荧光原位杂交：FISH端粒长度 \o 土壤成分分析标准物质-黄红壤 分析基于荧光肽核酸探针(PNA)特异性标识。PNA探针是DNA同源合成肽链，其中 \o 乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）定性及定量国家参考品 DNA带负电 \o 水质磷酸盐（标样） 磷酸戊糖骨架被不带电N-2胺乙基甘氨酸骨架所取代。这样修饰产牛了很稳定高效针对靶DNA特异性杂交。PNA探针发出 \o 硫酸奎宁荧光标准物质 荧光信号和所杂交端粒长度直接相关，所以这种方法可用于测量端粒长度。FISH不仅能够应用于单 \o 全血细胞溶液标准物质 细胞水平单个 \o 微小染色体维持缺点蛋白5(MCM5)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法) 染色体端粒长度测量，还可应用于组织匀浆及 \o 组织样品中莱克多巴胺迅速检测试... 组织切片(图5-5-2)。