细胞实验专题方案.docVIP

生科3班1组自主试验方案 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、试验目标 1、了解动物细胞培养、传代培养方法和培养过程中无菌操作。掌握人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备。 2、掌握细胞染色体制备方法，掌握人类染色体G－带显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中意义。 3、熟悉人类染色体镜下检验和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带特征及其识别。 二、试验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在合适培培养物中加入适量秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，能够获取大量分裂细胞。用低渗盐溶液（通常是0.075mol/LKCl）处置，使其中红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获取较好染色体。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，通常没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处置，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。经过显带，大家能够正确地识别每一条染色体及染色体上各个区段，并可发觉染色体上较细微结构改变。 在全部显带技术中，G显带（G banding）是最常见显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处置后，再用Giemsa染液染色，在一般显微镜下，可见深浅相间带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清楚，染色体标本能够长久保留，所以被广泛用于染色体病诊断和研究。 正常人类染色体数目为46条(23对)，1960年Denver会议和1963年London会议制订了统一人类染色体命名体制：根据染色体相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标识，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标识；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处置后，每条染色体全部显示出其特定带纹特征（见下表）。依据这些特征，能够正确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征 组别 染色体序号 形态，大小 着丝点位置 次缢痕 随体 判别程度 A 1~3 最大 M;中部着丝粒（1，3） 常见1号 无 可判别 B 4~5 次大 SM;亚中部着丝粒 ? 无 不易 C 6~12+X 中等 SM;亚中部着丝粒 常见9号 无 难判别 D 13~15 中等 SI;近端着丝粒 偶见13号 有 难判别 E 16~18 较小 16m.17m、18m;中部着丝粒 常见16号 无 可判别 F 19~20 小 M;中部着丝粒 ? 无 不易 G 21~22+Y 最小 St;近端着丝粒 有 有y无 难判别 三、试验试剂和器材 试剂： 培养基：RPMI1640,含有双抗（青、链霉素）和小牛血清；小牛血清；植物血球凝集素（PHA）；秋水仙素：50ug/ml；磷酸缓冲液：1/15mol/L,ph=6.8；低渗溶液：0.075mol/L氯化钾；Carnoy固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）；胰蛋白酶溶液； Giemsa（姬萨姆）染液；75%酒精、 器材： 光学显微镜，离心机，恒温水浴箱，恒温箱，离心管，量简，烧杯，培养瓶，载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，天平，一般冰箱，立式染缸、染色架、镊子，直头小吸管、橡皮吸头、吸水纸 若干，香柏油，擦镜纸，剪子，胶水。正常人类染色体G带核型图，核型汇报纸 四、试验方法 （一）培养液配制 试验室配好 （二）采血和培养： 抽取男生和女生外周静脉血2ml。常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁将血液滴入2个盛有5ml培养液培养瓶内，每瓶0.3ml，加入100ulPHA,盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。（天天摇动培养瓶一次） （三）秋水仙素处置: 向经恒温培养68-72小时(细胞生长到繁殖期即可)外周血淋巴细胞培养液中加入22ul秋水仙素，使其终浓度为0.6ug/ml,轻轻将液体摇匀，继续恒温培养3-6小时。 （四）标本制备: 1、收集细胞：终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀8分钟(1000r/min)，弃去上清液。 2、低渗处置：先加入1ml 0.075mol/l kcl溶液，轻轻吹打，使细胞重悬。然后补加6ml kcl溶液，37摄氏度低渗20分钟。 3、预固定：低渗处置完成后，直接加入新配Carnoy固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心8分钟(1000r/min)，去除上清液。 4、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，轻轻吹打混匀，置室温20分钟，离心去除上清液。 5、反复固定一次。 6、尽可能吸净上清液