中药综合检验技术 高效液相色谱法 高效液相色谱法.doc

分析化学教研室 第十七章 高效液相色谱法 【知识目标】 1．掌握：化学键合相色谱法，高效液相色谱法应用。 2．熟悉：高效液相色谱法原理、固定相和流动相的选择；梯度洗脱。 3．了解：高效液相色谱法特点及与经典液相色谱法和气相色谱法的区别；高效液相色谱仪结构、主要部件性能。 【能力目标】 1．识记：高效液相色谱法Van Deemter方程表示方法及其应用；正相色谱、反相色谱的概念，常用固定相和流动相；高效液相色谱仪主要部件、作用。 2．理解：正相色谱、反相色谱的出峰顺序；化学键合相法概念、类型及优点；高效液相色谱法常用定性方法。 3．应用：高效液相色谱法定量方法及应用。 案例分析 案例分析17-1 高效液相色谱法测定虫草发酵粉中黄曲霉毒素残留量 黄曲霉毒素可以由黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和伪溜曲霉4种曲霉菌产生，是一组化学结构类似的二呋喃香豆素衍生化合物。在植物来源的食物中，通常只污染黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中产生黄曲霉毒素B1的量比其他黄曲霉毒素多，而且B1的毒性最强，急性毒性是氰化钾的10倍，慢性中毒可诱发肝癌。虫草发酵药物所使用的某些原料可能被黄曲霉毒素污染，发酵过程的高温高湿环境也易造成黄曲霉素污染，所以应制订虫草发酵药物的黄曲霉毒素检查项，以控制产品质量，保证用药安全。 采用高效液相色谱法可以测定虫草发酵粉中黄曲霉毒素残留量，该方法快速简便，准确，可作为虫草发酵粉黄曲霉毒素的残留量测定方法，亦可作为原料药的黄曲霉毒素筛查方法，以达到控制产品质量的目的。 问题： 1．何谓高效液相色谱法？高效液相色谱法对流动相有何要求？ 2．高效液相色谱法如何选择分离条件？ 3．高效液相色谱法在药物分析、食品分析等领域中有哪些应用？ 第一节 概 述 一、高效液相色谱法特点 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引人了气相色谱的理论与实验方法发展起来的一种分析方法。其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱中，注入的试样被流动相带入柱内进行分离后，各组分先后进入检测器，用记录仪和数据处理装置，记录色谱图，并进行结果处理，定性定量分析。它采用了高效固定相、高压泵输液、高灵敏度检测器。 HPLC特点： （1）高效 采用5～10μm的均匀微粒填料，柱效可达每米3万片塔板数以上，可分离上百个组分混合物。 （2）高速 采用高压，载液流速快，分离分析一个试样中几个组分一般只要几分钟到几十分钟。 （3）高灵敏度 采用高灵敏度检测器（如紫外检测器），检测限可达10–7g～10–12g数量级，且所需试样量很少，微升数量级试样即可进行全分析。 （4）适用范围广 不受组分是否易挥发及热稳定性的影响，适用于高沸点、极性强、热稳定性差、相对分子质量大的高分子化合物以及离子型化合物的分析。能用于HPLC分析的有机物占有机物总数的75%～80%。 二、高效液相色谱法基本原理 HPLC的基本原理和气相色谱法基本相同，但由于液体与气体在密度、粘度、扩散系数上有较大差异。因此，在HPLC分离过程中，速率理论三项动力学因素对峰扩展的影响与气相色谱有较大差别。 根据式（16-7），液相色谱中纵向扩散系数为：B = 2γDm Dm为被分离组分的分子在流动相中的扩散系数（在气相色谱中用Dg表示）。 在液相色谱中，流动相为液体，粘度（η）比气体大很多，且柱温多采用室温，比气相色谱低得多，且Dm∝T/η，因此，液相色谱Dm约是气相色谱的1/105。其次，为了节约分析时间，一般采用的流动相流速至少是GC最佳流速的3～10倍。 因此，HPLC纵向扩散项B/u非常很小，一般可忽略不计。Van Deemter方程可表示为 H=A+Cu （17-1） 式（17-1）表明，在HPLC中，可以近似地认为流动相的线流速与板高成线性关系。 （一）涡流扩散项A 在HPLC中，A的含义与气相色谱法是相同的，可表示为：A＝2λdp 由于HPLC固定相是高效填料，颗粒更小，填充均匀，A值变得更小，柱效更高。为了使A减小，可从两方面采取措施： （1）采用小粒度、粒度分布均匀及球形或接近球形的固定相（填料） 填料的直径（dp）越小，A越小；但dp越小，越难填匀（λ大）。因此，通常多用dp在3～10μm之间的填料。选用球形与粒度均匀（RSD≤5%）的填料是为了降低λ。另外，球形填料有助于提高柱的渗透性，降低柱压。 （2）采用匀浆法装柱，降低λ 目前HPLC填充柱柱效已达到每米10万片。 （二）分子扩散项B/u 由于液体的扩散系数仅为气体的万分之一到十万分之一。因