实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察.docVIP

实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察 一、 实验目的 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术。 二、实验器具及试剂 1．器具 普通光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸。 2．试剂 M-缓冲液：咪唑、KCL、MGCL2、EGTA【乙二醇双醚四乙酸】、EDTA、疏基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)；（PH6.8）磷酸缓冲液（用NaHCO3调PH值）；Triton X-100，用M-缓冲液配制；考马斯亮蓝R250,其溶剂为：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml；戍二醛、乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶等。 3. 实验材料 洋葱鳞茎 三、实验内容 细胞骨架事由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。当用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可经细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，就是细胞骨架。 （一）溶液配制 （1）M-缓冲液配制： M-缓冲液(10×原液) ：咪唑34.04g，氯化镁 (MgCl2?6H2O)1.02g，EGTA（乙二醇双醚四乙酸） 3.8g，EDTA (乙二胺四乙酸)0.29g，巯基乙醇0.78g (0.7ml)蒸馏水加至1 000 ml。使用时，取100 ml (10×原液)加900 ml蒸馏水。 （2）6mmol/L（PH6.5）磷酸缓冲液配制： 甲液：NaH2PO4?2H2O，0.938g 溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000ml。 乙液：Na2HPO4 ?12H2O，2.15g加蒸馏水溶解，最后加水至1 000ml。 取甲液685ml，乙液315ml加蒸馏水1000ml即成6mmol/LPH6.5的磷酸缓冲液。 （3）1%Triton X-100，用M-缓冲液配制： 取22ml Triton X-100液加M-缓冲液至200ml。 （4）0.2%考马斯亮蓝R250： 考马斯亮蓝R250为0.2g，甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml （5）3%戍二醛，用磷酸缓冲液配制。 （二）实验方法与步骤 （1） 撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm2大小若干片）置于装有PH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。 （2）吸去磷酸缓冲液，用1% Triton X-100处理20~30min。 （3）吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10min。 （4）3%戊二醛固定0.5~1h。 （5）PH6.5磷酸缓冲液洗三次，每次10min。 （6）0.2%考马斯亮蓝R250染色20~30min。 （7）用蒸馏水洗1~2次，细胞置于载破片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。 （8）如观察效果好，可制作成永久切片。 在有样品的50ml烧杯中，顺序通过如下药物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2V95%乙醇+1/2V叔丁醇、叔丁醇（每级5-10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每级5-10min），然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好的，可加一滴中性树胶，盖上盖玻片，即成永久片。 四、实验报告 1．绘出植物细胞骨架微丝结构图。 2．分析在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征。