实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定.docVIP

第三章 实验内容 实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定 【目的】 验证蛋白质的两性电离与等电点性质。 【原理】 蛋白质由氨基酸组成。蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。因此，蛋白质具有两性解离性质。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（isoelectric point,pI）。蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。蛋白质在大于其等电点的pH值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH值溶液中则带正电荷。蛋白质在等点电以外的PH值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度来测定其等电点。 蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子 【器材】 试管、试管架、滴管、刻度吸管。 【试剂】 1. 5g/L酪蛋白醋酸钠溶液 称取纯酪蛋白0.5g，加蒸馏水40ml及1.00mol/LNaOH溶液10.0ml，振荡使酪蛋白溶解，然后加入1.00mol/L醋酸溶液10ml，混匀后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。 2. 0.1g/L溴甲酚绿指示剂 该指示剂变色范围为pH 3.8～5.4。指示剂的酸色型为黄色，碱色型为蓝色。 3. 0.02mol/L HCl溶液 4. 0.02mol/L HaOH溶液 5. 1.00mol/L 醋酸溶液 6. 0.10mol/L 醋酸溶液 7. 0.01mol/L 醋酸溶液 【操作】 1.蛋白质的两性电离 (1)取试管1支，加入5g/L酪蛋白醋酸钠溶液1ml，0.1g/L溴甲酚绿指示剂6～7滴，混匀后，观察并记录溶液的颜色。 (2)用细滴管缓慢滴加0.02mol/L HCl溶液，边滴边摇，直至产生明显的大量沉淀，观察并记录沉淀与溶液颜色的变化。 (3)继续滴入0.02mol/L HCl溶液，观察并记录沉淀与溶液颜色的变化。 (4)再滴入0.02mol/L NaOH溶液进行中和，边滴边摇，使之再度产生明显的大量沉淀，继续滴加0.02mol/L NaOH溶液，沉淀又溶解，观察并记录溶液颜色变化。 2. 酪蛋白等电点的测定 (1)取试管5支，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂并混匀。 表3-1 酪蛋白等电点测定 加入物（ml） 1 2 3 4 5 蒸馏水 2.4 － 3.0 1.5 3.38 1.00mol醋酸溶液 1.6 － － － － 0.10 mol醋酸溶液 － 4.0 1.0 － － 0.01 mol醋酸溶液 － － － 2.5 0.62 5g/L酪蛋白醋酸钠溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 溶液的最终pH 3.5 4.1 4.7 5.3 5.9 静置室温20分钟 (2)观察各管沉淀出现情况，并以－，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋ 符号记录沉淀的多少。 【结果及分析】 【思考题】 为什么说蛋白质是两性电离电解质，何谓蛋白质的等电点？ 蛋白质含有-COOH和-NH2两种基团 -COOH酸性基团,可以电离出H+ -NH2碱性基团,可以结合H+形成-NH3+,相当于结合H+使得电离出OH- 所以说是两性电离的 等电点就是蛋白质的净电荷为0的PH点 在等电点状态下，为什么蛋白质容易发生沉淀？ 由于蛋白质在等电点时净电荷为零,减少了分子间的静电斥力,因而容易聚集而沉淀,此时溶解度最小. 3.本实验中酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，由此得出蛋白质在等电点时必然沉淀，此结论对吗，为什么？ 优质解答 蛋白质在溶液中是呈胶体性质的. 也就是蛋白质自身所带的电荷与水分子形成了双电层,因为这种双电层的存在,使得蛋白质胶体互相排斥,不至于在做布朗运动的时候相互聚集. 等电点时,蛋白质的静电荷为0,也就破坏了这种双电层,导致蛋白质相互聚集在一起,从而形成大颗粒沉淀出来