提取RNA到PCR检测全部实验步骤.docVIP

提取RNA（以下步骤都在冰盒中进行） TRLzol加入培养皿中（1ml），静置5min后，将每个面都吹一下，转入1.5ml的离心管（附一） 加入氯仿，量为TRLZOL的五分之一，悬空打入，然后摇匀静置5min，然后离心：4℃，12000g，15min 吸取三层中最上层的水层，加入等量的异丙醇，悬空打入，混匀，静置10min，离心:4℃，12000g，10min，吸去上清液 加入1ml的75％的乙醇，离心：4℃，12000g，5min（重复两遍） 吸干酒精，静置10min使酒精风干，再加入20μl的DEPC水，加入后吹打几下，使RNA溶解。 用DEPC水稀释10-20倍，每份总量为10μl，既9μl的水和1μl的RNA，测RNA浓度（附二） 逆转录，总体系10μl，RNA加入量不超过500ng，但是尽量靠近500ng。 5×Prime 2μl RT Enzyme 0.5μl 10μlPrimer 0.5 10μl Random 0.5μl 6.5μl 6.5μl DEPC水 先配好前四样的混合液，后两样根据测的RNA浓度计算，保证RNA不超过500ng 按照要求加入药品，放入仪器中，设置HAO，10μl逆转录。 转录完成后，取1μl的样品，稀释10倍，用Q5000测浓度，一般都是120-130，所以可以稀释13倍，使cDNA不超过100ng。 算好总量，提前混合PCR体系：SYBR GREEN 12.5μl 算好总量，提前混合 使用前离心，再根据说明书溶解成母液，再稀释10倍成为工作液 DEPC水 10.5μl 使用前离心，再根据说明书溶解成母液，再稀释10倍成为工作液 前引物 0.5μl 后引物 0.5μl DNA模版 1μl 前后引物和模版稀释后都需要涡旋离心。加入SYBR GREEN需要避光，准备八连管。 PCR仪器使用前先打开预热30min，打开GFX manager软件，File里打开Protocol，选择设定好的程序，再点next，设定plate ， setting里的Target（目标名称）和Sample（样品名称） UNK目标引物名称 UNK 目标引物名称 样品名称 点击开始运行。 附一：台内操作手套在细胞间拿，所有物品进入都需酒精灭菌，离心管需用镊子夹出使用，出操作台要带上一层一次性的手套防止污染。 附二：测浓度需要用一组空白的溶剂进行BLANK，确定基线。，每份样品涡旋离心使其浓度均匀。使用Q5000进行测量 BLANK 空白校准 Measure 测样品浓度 Sample type 测量种类 260/280 纯度，2.0左右，不低于1.8 260/230 有机残留，2.0左右 每次用完都用二次水湿润的纸擦一次，干燥的纸擦一次，每个样品测三次。导出到Excel。退出系统exit 关闭机器，罩上罩子。