南方医科大学 GFP基因克隆.docVIP

GFP基因克隆 XXX　XX级临床XXX　XXXXXXXXX 摘要:目的　将所需的GFP基因片段转入特定的受体细胞—— pMDTM18-T Vector中。方法　用“重组质粒的提取”实验将所需的GFP基因片段从相应的细胞质粒——pEGFP-N1中提取出来，用“PCR扩增实验”将获得的DNA片段在体外扩增，进行“PCR产物的TA克隆”实验将获得的DNA片段与T载体——pMDTM18-T Vector连接，进行“大肠杆菌感受态细胞的制备及转化” 将重组DNA导入感受态细菌中，进行“阳性重组体的筛选”实验将含有GFP基因的感受态细菌从蓝白菌落中筛选出来，最后进行酶切实验对重组DNA进行鉴定。结果　经电泳实验发现在最后所得的四组转基因菌液中一组转基因成功。结论　GFP基因能够转入特定的感受态细菌中。 关键词：DNA片段、PCR、TA克隆、T载体、大肠杆菌感受态细胞、蓝白斑筛选、限制性酶切 绿色荧光蛋白（GFP）最早由Osamu shimomura于１９６２年在水母中发现，这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激光下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子相互作用。GFP由２３８个氨基酸碱基组成，GFP序列中的６５－６７位残基可自发形成荧光发色集团——对羟基苯咪唑啉酮。基因克隆是指在体外将不同来源的DNA分子进行切割、重新连接，组装成一个新的重组DNA分子。然后将重组DNA导入宿主细胞中进行扩增，获得大量同一DNA分子并表达相应蛋白质的过程。实现分子克隆所采用的方法与相关的工作统称为重组DNA技术，又称基因工程。 材料方法 １菌种 大肠杆菌DH5α由本研究室保存。 ２试剂 Premix Taq ? Version 2.0（用作PCR扩增实验）购自TaKaRa公司， pMDTM18-T Vector连接试剂盒购自TaKaRa公司，琼脂凝胶电泳试剂盒、10× M 酶切缓冲液、Hind III、EcoR I。 ３质粒DNA（pEGFP-N1）的基因扩增 取0.2 ml PCR反应管一支，按照pcr试剂盒说明书依次加样：首先加入H2O　6ml，然后加入质粒DNA（pEGFP-N1）2ml，分别加入引物GFP1 (10mM)、引物GFP2 (10mM)各1ml，最后加入Premix Taq 10ml。反应条件如下：94℃预变性5分钟后，30个循环（94℃ 30 秒　56℃ 30 秒 72℃ 1 分钟），72℃ 7 分钟，4 ℃ 保温。琼脂凝胶电泳分析。 ４构建重组DNA（T连接） 将PCR扩增产物与T载体——pMD18-T Vector进行连接，按照试剂盒说明进行加样，如图下： 实验组① 对照组② pMD18-T Vector 0.5 ml 0.5 ml PCR扩增产物 1 ml — Control Insert DNA — 1 ml ddH2O 3 ml 3 ml Solution I 5 ml 5 ml 总体积 10 ml 10 ml ５重组DNA的转化 首先制备感受态细菌：挑取一DH5a单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养。取其中500 ml菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间。取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟。加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟。4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成100 ml的小份，暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。 取其中一份进行转化。 接下来是重组DNA的转化：取感受态细菌100 ml，加入10 ml 连接产物，混匀并冰浴30分钟，42℃水浴 90秒，冰浴1-2分钟 ，加入800ml LB培养液37℃振荡培养45分钟，涂板（取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟，倒置平皿37℃培养过液）培养过夜。 ６重组DNA的筛选（蓝白斑） 用无菌牙签挑取白色单菌落接种于4mlLB/Amp+培养液中，37℃振荡培养过夜。 ７重组DNA的鉴定（酶切） 首先提取菌液中的质粒DNA。 在一个洁净的离心管中混匀下列反应物： H2O 6 μl 10× M 酶切缓冲液 2 μl 质粒DNA 10 μl (500~1000ng) Hind III 1 μl EcoR I 1 μl 总体积 20 μl 混合后37 ℃水浴1～2h，琼脂糖凝胶电泳分析。 结果 ２.１PCR扩增GFP基因 扩增质粒