氨基酸发酵生产技术 氨基酸发酵机制 课件（氨基酸发酵机制及菌种选育技术）.ppt

2) 与筛选营养缺陷型有关的三类培养基? ① 基本培养基(M.M.,minimalmedium)——能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。? ② 补充培养基(S.M., supplementalmedium)——在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。? ③ 完全培养基(C.M., completemedium)——可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。 3) 筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法? ① 诱变 常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。用15W或20W紫外灯管，距离15cm—30cm，照射lOsec—20min。在照射受试菌前，灯管须预热20min，使灯光稳定。菌悬液要磁力搅拌，使所有单细胞或单孢子均匀受到照射。特别要注意，应在黑暗或红外光下操作，接种后器皿用黑布包严，防止发生可见光的修复作用。? ② 淘汰野生型 ③ 检出缺陷型 ④ 鉴定营养缺陷型 十 紫外诱变育种方法 出发菌株菌悬液的制备 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h；（实训室已经制备完成） 取4ml培养液与5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加4ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min，以打散细胞； UV诱变 将紫外灯打开，预热30min； 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml； 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s、10s、15s、30s、45s，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯； 取取0.1--0..2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布布器涂匀。置37℃暗箱培养。（培养基平板已经制备完成） End Thanks! 氨基酸发酵机制及菌种选育技术 一、谷氨酸的生物合成途径及调节机制 谷氨酸的生物合成途径大致是： 葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成α－酮戊二酸。α－酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸的生物合成途径包括EMP、HMP、TCA循环、DCA循环和CO2固定作用等。 一）EMP途径、HMP途径 谷氨酸生产菌存在着两种代谢途径：EMP、HMP ；EMP/HMP=90/10，生物素量增加， HMP途径增加（26%，38%）。 二）TCA、DCA和CO2固定作用 1.TCA环（三羧酸循环） α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。在有NH4＋存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。 2.DCA环（乙醛酸循环） 菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。 3.CO2固定 体系中如果不存在CO2固定反应，则有： 则 3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 N + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） == 54.4% 体系中存在CO2固定反应，则有： 则有： C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 N + CO2 产率：147 / 180 == 81.7% 可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。 在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。 三）氨的导入 有三种方式： ① α－酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。 GA产生菌有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性 α