胰酶、EDTA的使用及注意事项.docVIP

胰酶（pancreatin)是一种自猪胰中提取的多种酶的混合物，主要为胰蛋白酶（将蛋白质消化成蛋白胨）、胰淀粉酶（将淀粉消化成糖)与胰脂肪酶（将脂肪消化成甘油和脂肪酸）。其通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。 不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。  胰酶本身就是消化蛋白的，而细胞膜又富含各种膜蛋白，消化过头会对细胞造成损伤的。 细胞之间是通过CAM（细胞粘性分子）相连的，而很多粘性分子只有在有+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+，的存在下才能行使这种功能。在胰酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子，使细胞被消化成单细胞形态。 EDTA是 \t /question/_blank 乙二胺四乙酸，一种金属 \t /question/_blank 螯合剂。一般和 \t /question/_blank 胰蛋白酶配合使用。原因在于，钙，镁等 \t /question/_blank 金属离子会降低胰 \t /question/_blank 酶活力，故在使用 \t /question/_blank 胰酶 \t /question/_blank 消化液时要配合加入EDTA。它可以螯合这些离子，消除对 \t /question/_blank 胰酶的抑制。 EDTA用得非常多,一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被中和。因此，消化下来的细胞要拿PBS洗一遍。 胰酶 这是用得最多的，常用浓度在0.25%。作用时间根据细胞种类、作用温度、作用ph等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁离子的平衡液，否则影响活性。终止是用血清蛋白，血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。保存于-20度。 胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，价格也较贵，不易保存，使用期限短，中止同样是用血清蛋白。 胰酶使用注意 1．在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌、支原体污染。2．胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，过长会损伤细胞，导致细胞铺板后生长状况较差。贴壁细胞的消化1．吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的死细胞/血清。2．加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量，室温放置2-5分钟（不同的细胞消化时间有所不同）。3．显微镜下观察，细胞明显皱缩成圆形，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者在瓶壁上有部分成点状区域细胞脱落；或者用手拍打克氏瓶正好能够使细胞脱落；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。4．此时加入含血清的完全细胞培养液停止消化，吹打下细胞，即可直接用于后续实验；如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’ 平衡盐溶液配制成0.25%溶液。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。 如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000rpm离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。 影响因素? 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。? 加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润。?? 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞