《生物化学》实验课件：实验二 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质.pptVIP

实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 教学目的： 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技术 实验原理、点样、电泳槽组装、 结果观察、透明各环节的把握 重点难点： 一、原理: 以醋酸纤维薄膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。 血清中的各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、等电点、分子量及形状不同，在电场中迁移速度不同。 我国正常人血清蛋白质组成 蛋白质名称 等电点 分子量 占总蛋白的百分比 清蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85—7.50 6.9万 20万 30万 9—15万 15.6—30万 56.70 3.74 7.65 11.53 20.30 + _ pH8.6 原理 二、 醋酸纤维薄膜作为电泳支持物的特点： 快速省时 色带分离清晰 灵敏度高，样品用量少 应用面广 便于保存 三、操作 1. 确定膜的非光泽面后，提前30 min润湿薄膜。 2. 制作电桥。（2层滤纸或4层纱布） 操作 3. 点样： 薄膜非光泽面朝上平放在滤纸条上 用玻片取样垂直的印在薄膜边缘1.5cm处形成一 定宽度、粗细均匀的直线 操作 样 品 带 窄 而 均 匀 4. 电泳： 薄膜点样面朝下，样品端朝负极平贴在电泳槽支架上，盖盖使膜平衡10 min。 操作 4. 电泳： 起始电流0.6mA/片，电泳10—15min后调至1mA/片，电泳50 min。电流回0，关机。 5. 染色2 min，漂洗液脱去背景颜色。 染色液重复使用 操作 置甲液2min，乙液1min， 贴于载玻片上，2min膜完全透明。 6. 透明： 7. 观察分析结果 电泳图谱显示的内容： 正负极 条带数目 条带宽窄 条带颜色深浅 条带形状 条带间距 操作 四、实验报告的格式及要求： 原理、操作（简明）。 铅笔绘电泳结果图谱，图谱要求显示以下内容： 正负极、条带数、条带间距、带型和各蛋白 质条带的名称。 3. 要求字迹整洁。 五、思考题 醋酸纤维薄膜电泳的特点； 根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计 它们在pH8.0的巴比妥-巴比妥钠电极缓冲液中 移动的相对位置。 实验二 唾液淀粉酶活性的观察 教学目的 掌握酶的化学本质； 酶催化作用的特点； 了解酶活性观察实验的设计特点。 实验原理； 实验现象的观察； 实验条件的把握。 重点难点 一、原理 酶活力 —— 酶催化化学反应的能力 加碘液跟踪水解过程： 淀粉 淀粉酶 淀粉酶 糊精 麦芽糖 + 葡萄糖（少量） 蓝色 紫色 红色 黄色或无色 蓝色 无色 时间短，酶活性高即酶的最适条件 酶活力受环境因素的影响。本实验通过观察温度、pH、激活剂、抑制剂等对酶活性的影响，掌握酶作为 生物催化剂的作用特点。 二、操作 （表3-1不做） 小组1位同学先用蒸馏水漱口三次，然后口含20ml蒸馏水2min，吐入塑料水杯，即得酶液。 1、唾液淀粉酶的制备 2、温度对酶活性的影响 操作 淀粉 + pH6.8缓冲液 + 酶液 冰浴 沸水浴 37℃ 淀粉 + pH6.8缓冲液 + 酶液 冰浴 沸水浴 37℃ 碘液检查37℃管呈无色 时同时向各管加碘液 2、温度对酶活性的影响 颜色 说明：… … … … 先冷却后加碘液 3、pH对酶活性的影响 淀粉 + pH 5.0 6.8 8.0 + 酶液 37℃ 碘液检查pH6.8管呈红色时同时向各管加碘液 颜色 说明：… … … … 4、酶作用的专一性 淀粉 蔗糖 + 酶液 37℃ 10min 斑氏试剂 2-5min 沸水 现象 说明：… … … … 5、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 淀粉 + 缓冲液 + 1%NaCl 1%CuSO4 蒸馏水 碘液检查1%NaCl 管呈红色时同时向各管加碘液 + 酶液 颜色 37℃ 说明：… … … … 淀粉酶活性观察的原理 操作（用表格表示） 结果（结果可附在操作表格中） 结果说明（紧随各实验操作之后） 三、实验报告要求： 了解酶作用特点后，应用酶时应该注意些什么？ 2. 酶性质鉴定实验的设计有什么特点？ 四、思考题 刻度吸管与试剂严格对应； 反应液必须充分混匀； 试剂、仪器及时回位； 实验结束各自清洁台面 及所用仪器； 5. 刻度吸管按图示清洁； 注意事项： 注意事项： 6、按图示整理好桌面即可离开实验室； 7、值日生负责整个实验室清洁，水、电、门窗