《生物化学》实验课件：实验四 垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶.pptVIP

教学目的： 实验五、聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 掌握聚丙烯酰胺凝胶分离乳酸脱氢酶的操作技术 3. 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 连续体系和不连续体系。 重点难点： LOGO Your site here 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶: 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。 电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。 * AP-TMTED催化体系 TEMED催化AP生成硫酸自由基： S2O82－ 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： Bis将单体长链间连成网状结构： LOGO Your site here 实验原理 O O O CH2 = CH—C—NH2 + CH2 = CH—C—NH—CH2—NH—C—CH = CH2 (Acr) (Bis) （聚丙烯酰胺） LOGO Your site here 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用； 样品用量少，灵敏度可达10-6g; 凝胶孔径可调节； 分辨率高。 * 凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。 大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。 当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。 * 聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。 * 不连续系统 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。 不连续电泳的四个不连续性 凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。 * 蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 电荷因素 分子大小 分子形状 * 关于乳酸脱氢酶 1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。 LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。 * 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下： LOGO Your site here 分离胶的制备 浓缩胶的制备 加样 待分离样品的准备 电泳 （电压100-120v，电流20mA） 染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色30min； LOGO Your site her