肌肉组织中DNA的提取课件.pptVIP

肌肉组织中 DNA 的提取 主讲内容 1 . 实验目的 2 . 实验原理 3 . 实验器材与试剂 4 . 实验步骤 5 . 注意事项 实验目的 ? 1. 学习并掌握动物组织中 DNA 的提取方法 及其原理 ? 2. 熟悉肌肉中提取 DNA 的基本操作以及使 用各个器材的基本方法。 ? 3. 了解现今从组织中提取 DNA 的方法 实验原理 动物的 肌肉、心脏、肝、肾、脾等 器官组织都是 DNA 的良好来源 , 其中肝脏的 DNA 虽然产量最大 , 但肝脏中 丰富的基因组 DNA 酶对提取的 DNA 降解比较严重 , 相对来 说，肌肉组织则由于具有相对少量的 DNA 酶而使得提取的 DNA 质量较好 , 尤其是新鲜组织的 DNA 产量高 , 质量好 。 肌肉 DNA 的提取一般有两种方法： SDS 法和异硫氰酸 胍法，但我们一般采用前一种，即 SDS 法。 DNA 是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于 细 胞核中 。通过研磨和 SDS 作用破碎细胞；苯酚和氯仿可 使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽 提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质； RNase 降 解 RNA ，从而得到纯净的 DNA 分子。 器材和试剂 ? 1 、仪器设备 恒温水浴锅、台式离心机、移液器、玻璃匀浆器、离心管、 吸嘴 ? 2 、试剂 （ 1 ）组织匀浆液： 100mM NaCl ， 10 mM 三羟甲基氨基 甲烷 (Tris)-HCl (pH8.0) ， 25mM 乙二胺四乙酸（ EDTA pH 8.0) 。（ 2) 2 ×细胞裂解缓冲液： 200mM NaCl ， 20 mM Tris-HCl (pH8.0) ， 50 mM EDTA (pH 8.0) ，蛋白酶 K (200 μg/mL) ， 1%SDS ( 十二烷基硫酸钠）（ 3 ）蛋白酶 K ：双蒸 水配制 10mg/mL ， -20 ℃保存 （ 4 ） TE 缓冲液： 10 mM Tris-HCl (pH8.0) ， 1 mM EDTA (pH 8.0) ，室温贮存 （ 5 ） 平衡酚 (pH8.0)/ 氯仿 / 异戊醇（ 25:24:1 ） （ 6 ） 3 M NaAc 、 冷无水乙醇、 70% 乙醇、灭菌水、生理盐水 ? 3 、材料 新鲜动物（兔子）肌肉组织 实验步骤 ? 1. 取新鲜或冰冻动物肌肉组织块 0.1g ，用冷生理盐水洗 3 次，置于培养皿中剪碎（动作要快），将碎肌肉组织转入 玻璃匀浆器中，加入 1mL 的匀浆液， 匀浆至不见组织块 （低温操作） ? 2 、将匀浆液倒入 1.5mL 离心管中（转前先静置一会，防 止未碎的组织进入离心管）， 5000rpm 离心 2min ； ? 3 、弃上清，沉淀加 0.25 mL 灭菌水，用微量移液器吸嘴 吹散悬浮沉淀，再加 0.25 mL 2 ×细 胞裂解缓冲液，盖上 离心管盖子，颠倒混匀； ? 4 、将离心管插入泡沫浮板中，置于 55 ℃恒温水浴锅中水 浴 2-3h ，可间歇性颠倒混匀离心 管数次； 实验步骤 ? 5 、加入等体积酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1) ，缓慢颠倒混匀， 冰上静置 10min ， 12000 rpm 离心 10min ； ? 6 、用钝化的黄吸嘴吸取上清水相（含 DNA ，粘稠）入另 一新 1.5mL 离心管中（注意不可 吸取两相间的蛋白质）； ? 7 、估算上清体积，加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，缓慢 颠倒混匀， 12000 rpm 离心 10min ； ? 8 、 用钝化的黄吸嘴吸取上清水相入另一新 1.5 mL 离心管 中，并加 1/10 体积的 3 M NaAc 和两倍体积的无水乙醇， 盖上离心管盖子， 缓慢颠倒混匀， 冰浴 30 min 后 10000 rpm 离心 5min ； 实验步骤 ? 9 、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将管口 的残余液滴除掉； ? 10 、用 1mL 预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀物， 10000 rpm 离心 1min ； ? 11 、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上吸去管口 的液滴，短暂离心，用吸嘴将附 于管壁的残余液滴除掉， 室温干燥； ? 12 、加 100μL TE 缓冲液重新溶解沉淀物，然后置于 4 ℃ 或 -20 ℃保存备用。