巴斯德毕赤酵母表达系统课件.ppt

巴斯德毕赤酵母表达系统 报告人：彭平平 起源及背景 ? 巴斯德毕赤酵母 ( Pichia pastoris ) 表达系统是 8O 年 代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。 ? 30 年前 Koichi Ogata 首次发现有些酵母可以利用 甲醇为唯一的碳源和能源 . ? 70 年代 Philips pertoleum 公司就开发出高密度连 续发酵生产毕赤酵母的工艺 ( 细胞干重 130g/L) 。 ? 80 年代由 Philips pertoleum 公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（ AOX ）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。 ? 1993 年 Philips pertoleum 公司委托 Invrtigone 公 司代理毕赤酵母表达系统的产品。 毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点 1 、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度 生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从 而进行高效表达 2 、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构 稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合 到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株 3 、毕赤酵母甲醇氧化酶 (alcohol oxidase ， AOX) 基 因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达 4 、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离 5 、毕赤酵母对外源蛋白产物进行 N 一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为 8 ～ 14 个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1 ， 3 连接的甘露糖残基 ( 有强的免疫原性 ) ，因而适用 于临床应用 6 、使用方便、简单，而且成本较低 醇氧化酶 （ AOX ） 甲醇 AOX 甲醛 H 2 O 2 微体 细胞 毕赤酵母质粒载体 几个概念 ? 同源基因重组 ：同源染 色体的非姐妹染色单体的 交叉互换引起的互换重组 ? 穿梭质粒：是指人工构建的 具有两种不同复制起点和选 择标记，可在两种不同类群 宿主中存活和复制的质粒载体。 pPIC9k 质粒图谱 ? AOX-- 醇氧化酶 ? S --- 分泌信号 ? MCS – 多克隆位点 ? TT --- 终止信号 ? HIS 4 -- 组氨醇脱氢酶 ? Kanamycin--- 抗卡拉霉素基因 ? pBR322--- 大肠杆菌的复制起始位点 ? Ampicillin--- 抗氨苄青霉素基因 外源蛋白的引入表达 菌株类型 Mut 表型与甲醇利用率 Mut 5AOX基因 3AOX基因 表型 Mut + 存在 存在 正表型 Mut s 缺失 存在 缓慢型 Mut - 缺失 缺失 负型 选择过程 HIS 4 缺陷培养基 G 418 酵母培养基 低 高 G418 ：是一种氨基糖苷类抗生素， Kanamycin 抗性 基因能对抗 G418 对酵母的毒性 导入质粒