环境监测 方法学习 高效液相色谱法原理及仪器结构.pptVIP

Environmental Monitoring 环境监测 Environmental Monitoring 环境监测 高效液相色谱法 ——原理及仪器结构 主讲教师 曹龙辉 莫家乐 ppt再整理 付翠彦 学习内容 高效液相色谱的基本原理 1 高效液相色谱的结构 2 ●高效液相色谱(HPLC)是色谱法的一个重要分支。 1. 工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内；由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别而被分离开；被分离后的单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式呈现出来。 一、高效液相色谱基本原理 2. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 一、高效液相色谱基本原理 ●高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需数小时。 ●高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高，可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 ●高灵敏度：检测器灵敏度极高：紫外UV—10-9g；荧光检测器—10-11g。 ●分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 ●流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或多种液体的混合，可供选择的机会多，它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 ●操作温度：GC 需高温；HPLC 通常在室温下进行。 一、高效液相色谱基本原理 3. HPLC 与GC 的比较 （ GC ：气相色谱） 4. 应用 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学、医学、环境监测等方面应用极为广泛，如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇等分析，大多是通过HPLC来完成的。 一、高效液相色谱基本原理 二、高效液相色谱结构 HPLC 仪器组成： (1)高压输液系统; (2)进样系统; (3)分离系统; (4) 检测系统; (5)数据显示系统。 此外还配有梯度淋洗、自动进样装置。 二、高效液相色谱结构 二、高效液相色谱结构 1. 高压输液系统（150～350×105 Pa） 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2 ?m，可防止颗粒物进入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（因为气泡会影响检测）。 3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和恒流型。 ●恒压泵：可迅速获得高压，但因泵腔体积大，在往复推动时会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。 ●恒流型：溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵（每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接脉动阻尼器)。 二、高效液相色谱结构 4）梯度淋洗装置： 在分离过程中逐渐改变流动相组成或极性（从而改变分配比k值）的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。 二、高效液相色谱结构 2. 进样系统 与GC 相比，HPLC 柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。 装入样品 出口 进样 采样环 泵入溶剂 进色谱柱 二、高效液相色谱结构 3. 分离系统 （色谱柱） 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色