纸层析法分离氨基酸剖析.ppt

纸层析法分离氨基酸 实验目的 1 、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析 法的操作技术 ( 包括点样、平衡、展层、显色、 鉴定及定量 ) 。 2 、学习未知样品的氨基酸成分 ( 水解、层析及 鉴定 ) 分析的方法。 实验原理 层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944 年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技 术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和 高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也 迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既 可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制 备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛 应用而又必不可少的分析工具之一。 分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中 的分配情况不同而使之得到分离的方法。 分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 ( 固定相 和流动相 ) 间分配系数的不同。 分配系数 (K) 的定义是： K= 溶质在固定相的浓度 (CS)/ 溶质在流动相的浓度 (CL) 二、纸层析 ( 一 ) 原理 纸上层析实际上是以滤纸纤维的 结合水为固定相 ， 而以 有机溶剂 ( 与水不相混溶或部分混溶 ) 作为流动相 。 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数， 移动速度因此不同，从而达到分离的目的。 溶质在滤纸上移动的速率可用 R f 值 表示： R f = X/ Y 式中 X ： 溶质斑点中心的移动距离 Y ： 溶剂前沿移动的距离 R f 值决定于分配系数。 不同物质的分配系数不同， Rf 值也不相同，由 此可以根据 Rf 值的大小对物质进行定性分析。 ( 二 ) 影响 R f 值的主要因素 1. 物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响 R f 值的主要因素。 极性较大 的物质，在水中的溶解度较大， 其 R f 值就较小 ，反之亦然。 2. 滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的 水量 不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同 型号的滤纸上进行层析时，所得到的 R f 值也不相同。 此外，滤纸上所含的 杂质 也会影响 R f 值。 3. 层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时， R f 值不同。所 以溶剂的配制和使用必须严格，才能使 R f 值的重现性好。在好 的溶剂系统中被分离物质的 R f 值应在 0.05-0.85 之间，样品中 被分离组分的 R f 之差最好大于 0.05 。 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使 用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、 碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等 4.pH 值 溶剂和样品的 pH 值会 影响物质的解离 ，从而影响物质的 极性和溶解度，使 R f 值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的 含水量增高，使极性物质的 R f 值增加；反之则降低。 为了避免或减少 pH 值对 R f 值的影响，可将滤纸和溶剂用 缓冲溶液处理，使之保持一定的 pH 值。 5. 温度 温度能 影响物质在两相中的溶解度 ，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的 水合作用 ，即影响固定相的体积 . 所以温度 的改变使 R f 值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。 6. 展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同 的展开方式进行层析时，所得到的 R f 值不相同。用 下行法 展 开时， R f 值较大；用 上行法 展开时， R f 值较小；用 圆形滤纸 层析 时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动， R f 值也较 小。 7. 样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对 R f 值有所影响。例如： 氯化钠的存在会影响氨基酸的 R f 值。 ( 三 ) 操作方法 1. 样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定 的 pH 值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需 稀释。 2. 点样 将滤纸裁成适当大小，用 铅笔 在距边线 2cm 左右划一直 线 ( 称为原线 ) ，线上每隔 2-3cm 划一