自学自讲基因敲除解析.ppt

基 因 敲 除 技术及其应用 Your site here Contents 基因敲除的步骤及方法 2 基因敲除的定义 1 基因敲除的应用 3 4 Your site here Sub title 基因敲除的定义 基因敲除 ( Gene knockout) 是指一种遗 传工程技术，针对某个序列已知但功能未知 的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基 因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障， 并可进一步对生物体造成影响，进而推测出 该基因的生物学功能。 Your site here 基因敲除的基本步骤 第一步： E S 细胞的获得 第二步：重组载体的构建 第三步：重组 DNA 转入受体细胞核内 第四步：目的细胞的筛选 第五步：转基因动物的获得 Your site here 基因敲除的方法 一． C r e - L o x P 系统 C r e -L o x P 系统属于传统的同源重组载体 , 但是 具有了时空调控的功能 。它由 C r e 重组酶和 L o x P 位 点两部分组成。 C r e -L o x P 系统可以实现对基因的不同发育阶段 、 不同组织类型中特异性的删除 , 可以消除由于基因位 置改变造成的影响 , 加强了对基因的控制能力 , 使研究者 可以更方便地有针对性地进行目标阶段的研究工作 ;C r e -L o x P 系统可以实现染色体间的基因重排 ; 但同时也 可以看出该系统对基因的了解要求极高 , 并且对基因片 段的操作能力要求也很高 , 基因片段的大小通常在 10 k b 以上 , 这些都不利于研究工作进行。 Your site here 基因敲除的方法 二．转座子系统 转座子系统自从 20 世纪 50 年代被 Mc C l i n t o c k 发现以来 , 已经成为许多组织器官进行基因分析的工具 。在人和小鼠的基因组中 , 转座子衍生序列多达整个基因 组的 40 %, 这提示在发育过程中转座子有重要作用 。 转座子系统易于操作 , 所需时间短 , 具有高通量的特 点 , 可以携带多种抗性标记 , 方便了同时进行多基因功能 研究。但其应用范围有限 , 适用于有一段克隆到的原始基 因组序列 , 长度在 10 ～ 15 k b , 且转座子应满足以下条件 : ①转座子本身应该很短 , 易于操作 , 并对任何期望敲除区 域有高效率 ; ②在删除目的区域后应留下足够长的两臂用 于同源重组。这些都限制了转座子的应用。 Your site here 基因敲除的方法 三．基因捕获载体系统 基因捕获技术是将突变基因导入小鼠 E S 细胞从而获得小 鼠基因组文库 , 进行小鼠基因组的功能研究 , 它属于大规模 随机敲除。典型的基因捕获载体通常包括一个无启动子的 报道基因 , 并通过调控元件使含有小鼠基因组文库的 E S 克 隆很容易被选择性培养基筛选出来。 Your site here 基因敲除的方法 四． H i t 和 R u n 法 H i t 和 R u n 法也称进退策略 。它包括两次同源重组 : 第一步 ( H i t ) 用插入型载体进行同源重组 , 在靶位点插入 带有突变的基因组序列以及带有两个筛选标记 ( 如 n e o 和 t k ) 的载体序列 ; 第二步 ( R u n ) 利用 t k 抗性筛选 , 富集发 生去除了含有负筛选标记基因的载体序列的回复突变的克 隆 。 H i t 和 R u n 法的不足之处是 : ①无法精确控制染色体 内的同源重组 , 可能会失去携带突变的同源序列 , 而保留 未修饰的内源片段 ; ②整个过程需要采用两种培养基分别 进行先后两次筛选 ; ③无法同时引进多个位点突变 。 Your site here 基因敲除的方法 五 . 双置换法 双置换法也属于精细突变敲除 。它首先用含有 H p r t 基因的打靶载体转染 H p r t - E S 细胞 , 通过在次黄嘌呤 、 氨喋呤和脱氧胸腺嘧啶苷培养基中筛选并用 P C R 进行基因 组分析 , 筛选发生