内毒素检查[文字可编辑].ppt

细菌内毒素检查 目录 ? 1 、实验原理 ? 2 、实验试剂 ? 3 、试验器具 ? 4 、检查方法概述 ? 5 、供试品溶液的制备 ? 6 、内毒素限值的确定 ? 7 、最大有效稀释倍数（ MVD ）的确定 ? 8 、鲎试剂灵敏度复核 ? 9 、干扰试验 ? 10 、供试品的细菌内毒素检查 实验原理 ? 利用鲎试剂与微量内毒素产 生凝集反应的现象，以判断 供试品中细菌内毒素的限量 是否符合规定的一种方法。 阳性结果 ? 细菌内毒素的量用内毒素单位 (EU) 表示。 实验试剂 ? 鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎” 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解 物，经低温冷冻干燥精制而成的生 物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌 内毒素的最低有效浓度表示，即鲎 试剂的灵敏度，单位为 EU/ml 。 当使用新批号的鲎试剂或试验条 件发生可能影响检验结果的改变 时，应进行鲎试剂灵敏度复核试 验。 实验试剂 ? 细菌内毒素国家标准品 系自大肠埃希菌提取精制得到的 内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试 剂灵敏度。 ? 细菌内毒素工作标准品 系以细 菌内毒素国家标准品为基准标定其 效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复 核、干扰试验及各种阳性对照。 ? 细菌内毒素检查用水 指内毒素 含量小于 0.015EU/ml （用于凝胶法） 或 0.005EU/ml （用于光度测定法） 且对内毒素试验无干扰作用的灭菌 注射用水。 试验器具 ? 刻度吸管、凝集管（ 10 × 75mm ）、三角瓶、小试管 （ 16 × 100mm ）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管 帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 ? 耐热器皿常用干热灭菌法（ 250 ℃ 、 30 分钟以上）去除， 塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 （目前多为无热原的一次性用品 ） 。 试验准备 1 、清洗干净的玻璃容器、注射器、镊子、剪刀等放入金属 制容器内密闭加热去热原，达到时间后，关闭电源。待烤 箱温度自然降低至室温，在不开启金属容器的情况下，可 一周内使用，否则必须再次加热除去可能存在的外源性内 毒素。 2 、塑料制品清洗干净后在 30% 的双氧水中浸泡 4H ，再用无 热原水充分冲洗后在 60 ℃ 烘箱中烘干备用，一般我们会把 枪头装入盒中进行湿热灭菌。 3 、试验前应先把水浴锅或恒温器温度调到 37 ℃ ± 1 ℃ 。 检查方法概述 ? 凝胶法 限量试验 半定量试验 ? 光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法） 凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁” 方法 对干扰相对不敏感。 较光度测定法不灵敏 供试品溶液的制备 ? 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸 提制成供试品溶液。 ? 一般要求供试品溶液的 pH 值在 6.0 ～ 8.0 的范围内。 ? 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节 pH 值。 内毒素限值的确定 ? 一般按公式： L=K/M 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以 EU/ml 、 EU/mg 或 EU/U （活性单位）表示。 K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射 剂 K=5EU/ （ kg· h ），放射性药品注射剂 K=2.5EU/ （ kg· h ），鞘内用注射剂 K=0.2EU/ （ kg· h ）。 M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品 使用说明书，《临床用药须知》确定。 ? 例： 某产品 M 为 14.3mg/kg ， L=5/14.3=0.35EU/mg 假如此产品的浓度为 100mg/ml ，那么， L=0.35 ? 100=35EU/ml 最大有效稀释倍数的确定 ? 最大有效稀释倍数（ MVD ） 指在试验中供试品溶液 被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进 行内毒素限值的检测。 ? MVD=cL/λ 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值； c 为供试品溶液的浓 度，当 L 以 EU/ml 表示时，则 c 等于 1.0ml/ml ，当 L 以 EU/mg 或 EU/U 表示时， c 的单位需为 mg/ml 或 U/ml 。如 供试品为注射用无菌粉末或原料药，则 MVD 取 1 ，可计算 供试品的最小有效稀释浓度 c=λ/L ； λ 为在凝胶法中鲎试剂 的标示灵敏度（ EU/ml ）。 鲎试剂灵敏度复核 ? 目的 考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人员操作 方法是否正确及实验条件是否符合规定。 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果 的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ? 细菌内毒素标准溶液的准备 1 、 取细菌内毒素工作标准品（或 国家标准品）一支，轻弹瓶壁， 使粉末落入瓶底，然