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蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测 蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化 ,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多 克隆抗体进行识别。 关键词： 印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹 Westernblottingimmunoblotting 免疫印迹法蛋白质印迹 法 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法， 这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技 术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化 ,另外这项技术的应用需要 利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。 如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以 及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离； 通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙 烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。 值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白， 如牛 血清 白蛋白对膜进行 “封阻 ”而防 止抗体与膜的非特异性结合。 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上 ,我们把这个过程称 为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为 : 1.半干法 : 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的 滤纸之间,通电时间为 10 分钟~30 分 钟。 2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从 45 分钟延长到过夜进 行。 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料， 因此我们在这里只描述湿法 的基本操作过程。 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。 该抗体往往是购买的成品， 已经被 结合或标记了特定的试剂， 如辣根过氧化物酶。 这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一 个比色反应， 该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上， 容易鉴别。 因此可通过对二 抗的识别而识别一抗， 进而判断出目标蛋白所在的位置。 其他的识别系统包括碱性 磷酸酶 系 统和 125 I 标记系统。 1. 实验器材 SDS /PAGE 实验相关材料；电转移装置；供电设备； PVDF 膜（Millipore Immobion-P #I PVH 000 10）；Whatman 3MM 纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或 玻璃容器、浅盘。 易生物仪器库： /yp/product-list-42.html 易生物试剂库： /yp/product-list-43.html 2. 实验试剂 ⑴ 10x 转移缓冲溶液（ 1L ）：30.3g Trizma base(0.25M), 144 g 甘氨酸 (1.92M), 加蒸馏 水至 1L, 此时 pH 约为 8.3 ，不必调整。 ⑵ 1x 转移缓冲溶液（ 2L ）：在 1.4L 蒸馏 水中加入 400 ml 甲醇及 200 ml10x 转移缓冲溶 液。 ⑶ TBS 缓冲溶液 :将 1.22g Tris (10 mM) 和 8.78g NaCl(150 mM) 加入到 1L 蒸馏水中， 用 HCl 调节 pH 至 7.5 。 ⑷ TTBS buffer ：在 1L TBS 缓冲溶液中加入 0.5ml Tween 20 （0.05% ）。 ⑸ 一抗：兔抗待测蛋白抗体（多克隆抗体）。 (6) 二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔。 ⑺ 3% 封阻缓冲溶液 （0.5L ）：牛 血清 白蛋白 15mg 加入 TBS 缓冲溶液并定容至 0.5L ，过 滤，在 4°C 保存以防止细菌污染。 ⑻ 0.5% 封阻缓冲溶液（ 0.5L ）：牛血清白蛋白 2.5mg 加入 TTBS 缓冲溶液并定容至 0.5L ， 过滤，在 4°C 保存以防止细菌污染。 ⑼ 显影试剂： 1ml 氯萘溶液 (30mg/ml 甲醇配置 )，加入 10 ml 甲醇，加入 TBS 缓冲溶液 至 50 ml，加入 30 ul 30% H2O2。 ⑽ 染色液： 1g 氨基黑 18B (0.1%) ，250ml 异丙醇 (25%) 及 100ml 乙酸 (10%) 用蒸馏水定容 至 1L。 ⑾ 脱色液：将 350ml 异丙醇 (35%) 和 20 ml 乙酸 (2%) 用蒸馏水定容至 1L。 【实验操作】 ⒈ .蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率，通常采用 SDS / PAGE 技术。 分离实验结束后， 首先将样品墙的上边缘用小刀去除， 然后在胶板的右上角切一个小口以便 定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。 ⒉ .电转移 ⑴ 准备PVDF 膜 根据胶的大小剪出一片 PVDF 膜，膜的大小应略微小于胶的大小。将膜置于甲醇中浸泡1 分钟，再移至转