11 结构生物学导论 4.ppt

Step 1 temp.sca temp.mtz CCP4 程序包中的 scalepacktomtz 程序 Step 2 temp.mtz Solve.pdb Phaser 程序 Step 4 phenix.refine solve.pdb temp-freeflag.mtz Step 5 Coot 程序 电子密度图和修正后的原子坐标文件 Model.pdb Step 3 temp.mtz temp-freeflag.mtz CCP4 程序包中的 freeflags 程序 多对同晶置换法 Multiple-isomorphous replacement （ M I R) 制备至少两个 同晶 的重原子衍生物 ? 与母体空间群相同 ? 晶胞参数只有微小的差别（ 0.5-1%) ? 除了在某些位置上增加了重原子外，其他对应 的原子位置都相同（不扰乱蛋白分子的构象和 晶格堆积） 重原子浸泡 用 浸泡法 制备重原子衍生物 实践 浸泡液组成与晶体生长的槽液相似，含重原子试剂 重原子试剂的 种类 : 如 K 2 PtCl 4 (Cl ? CN, NO3), Pt(NH 3 ) 2 Cl 2 , K 2 AuCl 4 (Cl ? CN, NO 2 ) ( 主要与 Met 结合 ) Hg(OAc) 2 (OAc ? Cl) , 有机汞化合物 ( 主要与 Cys 结合 ) Na 3 IrCl 6 (Na ? K, NH 4 ) ( 主要与 Lys 结合 , 温和 , 溶解度高 , 可用到 100mM) UO 2 (NO 3 ), (NO 3 ? OAc) 稀土元素等 浓度 （常用 0.1-10 mM ，可分步浸泡以减少对晶格的破坏） 浸泡 时间 （ hrs-days) ( 首次实验可试 1mM,1 天 ) 要求： ? 同晶度好 ? 结合位点少 ? 占有率高 差值 Patterson 函数 生物大分子 : Patterson 函数不能直接反映重原子位置 ? 母体衍射数据 I P → |F P | ? 重原子衍生物衍射数据 I PH → |F PH | ? 计算 差值 Patterson 函数 ，解出重原子位置 P(uvw)= （ 1/v ） ∑∑∑ ( |F PH |- |F P |) 2 exp[-2 ? i (hu+kv+lw)] h k l 差值 Patterson 峰代表 重原子间矢量 ? 重原子位置 计算 F H ? 重原子位置的精修（如用最小二乘法） ? 计算 重原子对结构因子的贡献 F H N F(hkl)=K∑q j f j exp[2 ? i (hx j +ky j +lz j )-B j (Sin ? / ? ) 2 ] j=1 只对重原子加和 ? F H, ? H 矢量三角形 F PH = F P + F H 复数加和 ( 矢量加和 ) 至少用两个重原子衍生物才可唯一确定相角 已知 |F P | |F PH | F H 电子云密度和结构解析 F (hkl) = V ? ? ? ? (x,y,z) exp [2 ? i (hx+ky+lz)]dxdydz x=0 y=0 z=0 1 1 1 电子密度函数 ? (xyz) = （ 1/v ） ∑∑∑ F hkl exp[-2 ? i (hx+ky+lz)] h k l F hkl = | F hkl | exp (i ? hkl ) Fourier 加和 , 采用用快速 Fourier 变换技术 通常在三维晶胞中按 d min /3 的格点进行计算 分析电子密度图 → 二级、三级、四级结构 结构模型，原子坐标 ( 不包括 H 原子 ) 0,0 y x 0.05 0.05 (x,y,z) = (0.05,0.05,0) 32 45 30 48 69 47 29 49 32 31 28 解决相位问题的方法 ? 差值 Fourier 法 与已知结构差别很小且同晶 ? 分子置换法 （ MR) 有已知相似结构而不同晶 ? 独立位相：单波长反常散射法 (SAD) ；多波长反常散射 法（ MAD) ，多对同晶置换法（ MIR ） 无已知相似结构 ? 直接法 差值 Fourier 法 适用于未知结构与已知结构差别很小且同晶时 （如定点突变体、蛋白与小分子的复合物 ) △ ? (xyz)=(1/v) ∑∑∑ ( F 未知 -F 已知 ) exp[-2 ? i (hx+ky+lz)+i ? 已知 ] h k l 未知结构与已知结构的差异 + 缺少原子， - 多余原子 调整模型 衍射数据 已知结构 |Fo 未知 | - |Fc 已知 | 已知结构 ? P ?? (xyz) F =