超滤管使用方法及注意事项.docVIP

超滤管使用方法和注意事项 蛋白浓缩和换 Buffer 通常使用的超滤管，常用 Millipore 的 Amicon-Ultra-15 超滤管（ MWCO10kD）。也有其它型号 的、不同体积大小和 MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、 浓缩目标体积而定。 可重复使用， 使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方 法和注意事项。 1、选择合适的超滤管，主要考虑 MWCO和浓缩体积，最常见的是 Ultra-15 （ 10kD）。到底选择多大截留分子量比较合适呢？ 10kDa、 5kDa、还是 30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的 1/3 ，比如目的蛋白分子量为 35kDa，就可以选择 10kDa 截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为 10kD左右，则可以用截留分子量 3kD 的超滤管。认真阅读使用说明书， 注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。 2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入 MilliQ 水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。 3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直 接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至 4 度）。不同离心机的转速 rpm 换算成 g 之后，有所不同。 具体可参阅附件里的说明书。 离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。 注意，一定要等离心机达到目的转速之后， 方可离开 离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方 向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速 开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。 4、当浓缩到剩下 1ml 时，【取 50ul 国产 Bradford 溶液，加入 10ul 流穿，看有 没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将 上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用 5mg/ml 的 BSA离心 10min，再取流穿，跑蛋白胶或 Bradford 粗测】，继续加入 剩下的蛋白液浓缩 （在冰上操作，防止蛋白受热） ，直到所有浓缩液都加完为止。 离心过程中注意是否发生蛋白沉 淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原 因，是蛋白浓度过高还是 Buffer 不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的 Buffer ，直到蛋白不发生沉淀为 止。 5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换 Buffer ，在总蛋白液浓缩至 1ml 左右的时 候，轻轻加入新的 Buffer （经 0.22um 超滤膜超滤），再 浓缩至 1ml 左右，连 续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于 500ul ， 也有浓缩至 200ul 以内的情况。按照每次至少 10 倍 左右的体积浓缩算， 三次达到 1000 倍以上，基本上可以达到换 buffer 的目的。 6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（ 200ul ）取，轻轻顺着边 缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取 浓缩液，每次吸接近 200ul ，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度 太大，有可能损坏超滤膜。最后加入 MilliQ 水到超滤管中，没过 超滤膜，防止膜失水变干。 7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。 8、倒出超滤管里的水， 用 milliQ 水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀， 可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬 起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入 0.2M 的 NaOH溶液，室温放置 20min，期间平衡超滤管。再离心 10min。倒出残留的 NaOH溶液，将 管芯浸入 MilliQ 水的烧 (1 或 2L) 中, 放置几个小时 , 再换新的水 , 放置几个小时，不断稀释 NaOH浓度。 50ml 管和盖子用自来水洗，内壁再用 MilliQ 水洗干净。 9、取出浸没的管芯，加至接近满的 MilliQ 水， 50ml 管也加满 MilliQ 水，将管 芯慢慢放入 50ml 离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放 4 度保存，直到下次 使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。 实验室常用储存液的配置参数 1．30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】将 29g 丙烯酰胺和 1g N，N’ - 亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中。加热至 37℃溶解之，补加水至终体积为 100ml。用 Nalgene 滤器（0.45 μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的 pH值应不大于 7.0 ，置棕色瓶中