影响亲层析主要因素.ppt

转硫酶的制备 勤力学研究 实验 禁和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 测定酶活力、米氏常数和最大反 应速 Foin-酚法测定蛋白质含量,计 算比舌 前考题 1.关于谷胱甘肽转硫酶。 2.生物大分子的制备前期实验材料的预处理和蛋白 质的提取方法。 令3.亲和层析的原理,影响亲和层析的因素。 4.关于配基、载体及配基的偶联。 ÷5.本实验中BufA和B中各组分的作用是什么? ÷6.实验中应注意的问题 谷胱甘肱转硫蓐简介 谷胱甘肽转硫酶( Glutathion S- transferases, 简称GSTs,EC2.5.1.18)广泛存在于动物和人体的 各种组织,哺乳动物肝脏中含量最高,约占肝可溶性 蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的 同工酶家族,均为由两个亚基组成的二聚体,相对分 子质量为45000-49000,各同工酶的等电点不同, 多为碱性同工酶。 兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化 物的解毒作用,GST催化这些带有亲电中心的 疏水化合物与还原型谷胱甘肽(GSH)的亲核 基团GS一反应,中和它们的亲电部位,使产物 水溶性增加,经过一系列代谢过程,最后产物 为巯基尿酸,被排出体外,从而达到解毒目的。 另外,GST还能共价或非共价地与非底物配基 以及多种疏水化合物结合,具有结合蛋白的解 毒功能。 亲和层析原理 有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆 结合的特性,如酶与其底物、抑制剂、辅助因子,抗体 与抗原,核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋 白,激素与其受体、载体蛋白,细胞与其表面特异蛋白 等等,它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合,这 种专一的可逆结合力的称为亲和力。亲和层析的方法就 是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原 理建立和发展起来的。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基, 与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联,制成专一的亲 和吸附剂,当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时,亲 和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质,通过解吸 附使待分离物质得以纯化 亲和层析的优点:专一性结合,分辨率高,操作简单, 通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质;具有浓缩 作用,可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品;利用 生物学的特异性进行分离,所以分离条件比较温和,能够 很好地保持样品原有的生物学性质。 亲和层析法分离生物大分子示意图 配基 待分离的 生物分子 b 载体手臂配基亲和吸附剂 5公一 样品 杂质 +自 与待分离物质 专一可逆结合 的物质 亲和层析介质的制畚 配基的选择:选择合适的配基是亲和层析中的重要环节, 配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离 物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进 行选择,通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性 抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶,选择互补的碱 基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯 化核酸等等。在亲和层析中,分离生物大分子的配基必须有 适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用,有较高的偶联 率,偶联后配基和被分离生物大分子的专一结合特性不变 有效地分离目标产物;解吸附时不破坏生物大分子的生物活 性和理化性质。