免疫学技术在科研中的应用PartIII.ppt

基础理论 CTL 为细胞毒性 T 淋巴细胞的简称。是 CD8 ＋ T 细胞识 别 APC 表面 MHC I 类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗 原肽后，分化形成的。当 CTL 遇到相应的肿瘤细胞或 病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机 制杀伤靶细胞。 1. 细胞接触机制 CTL 表达 FasL ，靶细胞表达 Fas ， FasL 与 Fas 的配接，通 过 Fas 传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶 细胞死亡。 2. 细胞裂解机制 CTL 激活后，胞质内颗粒向 2 个细胞接触点移动。颗粒 膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插 入靶细胞膜后聚合，在细胞膜上形成孔，造成细胞裂 解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。 ? 51 Cr 释放法： 在将靶细胞与 CTL 混合之前，先用放射性核素 51 Cr 培育 ， 51 Cr 能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不 能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被 CTL 破坏后， 51 Cr 被释放进入上清 。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放 射性强度，就可以判定 CTL 杀伤能力。 ? LDH 释放法 : 酸脱氢酶（ LDH ）在胞浆内含量丰富，正常时不能通 过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液 中 LDH 活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔 LDH 活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤 % 。本法操作简便快 捷，自然释放率低，可用于 CTL 及 NK 细胞活性测定及药物、化学物质 或放射引起的细胞毒性，应注意较高浓度 FCS 中所含 LDH 可能干扰结果 。 方法： 1. 从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。 2. 51 Cr 标记肿瘤细胞。 3. 96 孔培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比 为 50:1 ， 25:1 ， 12.5:1 。另设最大释放对照（靶细胞加 去污剂）和自发释放对照（不加 CTL ）。 4. 37C °， 5 ％ CO 2 ， 4h 。 5. 收集上清， ? 计数器测定放射活性（ cpm ）。 计算公式 试验组平均 CPM 值－自发释放组平均 cpm 值 ％溶解＝ 最大释放平均 cpm 值－自发释放平均 cpm 值 注意事项 由于 CTL 杀伤靶细胞受 MHC 限制，所以靶细胞必须来自自身， 或选用表达适当 MHC 的肿瘤细胞系。 优点 ： 方法简单、快速，能定量。 缺点 ： 自然释放率高，需要靶细胞量多。使用放射性核素。 应用实践 这一方法常用于评估肿瘤患者 CTL 杀伤肿 瘤的能力，可作为判断雨后和观察疗效的指 标之一。 ? 免疫细胞的分离 ? 密度梯度分离法 ? 磁珠分离法 ? fluorescence-activated cell sorter ， FACS ? 免疫细胞功能的测定 ? T 细胞 ? B 细胞 ? 巨噬细胞 ? NK 细胞 ? 外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫 学实验中最常用的细胞群，也是进行 T 细胞和 B 细胞分离纯化的重要环节。 PBMC 的密度与血液中的其他成分不同 : ? 血小板的密度为 1.030 ～ 1.035 ， ? 粒细胞为 1.092 ， ? 红细胞为 1.093 ， ? 淋巴细胞和单核细胞的密度为 1.075 ～ 1.090 。 ? 利用一种密度介于 1.075 ～ 1.092 之间、近于等渗的溶液 ( 分 层液 ) 进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相 应密度分布，从而被分离。 ? 常用的分层液有聚蔗糖 - 泛影葡胺 Ficoll-Hypaque 分层液 法和 Percoll 分层液法两种。 ? 聚蔗糖 - 泛影葡胺分层液法是分离 PBMC 一种单次密度 梯度离心分离法 ? 特异性分离所需淋巴细胞的方法。 ? 将特异性抗体 ( 如抗 CD3 、抗 CD4 、抗 CD8 等 ) 吸附在铁颗 粒 ( 磁珠 ) 上，加至细胞悬液中，具有相应抗原的细胞 与磁珠上的特异性抗体结合。 ? 反应管置于磁场中，铁颗粒受磁场的吸引，携带有相 应细胞的磁球吸附于靠近磁铁的管壁上。 ? 弃细胞悬液，重新解离细胞与磁珠。 autoMACS?Pro Separator Walk-away cell sorting of multiple samples CliniMACS? Plus Instrument The CliniMACS?System — a closed and sterile system for separation of large cell samples ? 使用酶、免疫荧光标记单抗进行鉴定 Th1