病毒接种、收获尿囊液操作步骤.docVIP

. .. . . . . . w 病毒接种 选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象的鸡胚。 标记注射点：接着用记号笔在气室上方约1mm处画线，在线的下方挑选 注射点，在挑选注射点时应注意避开主血管，避开鸡头。 3.打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒，用打孔器在气室线上方打孔。注意：孔不宜过大，否则会导致封蜡不完全，甚至将蜡油流进鸡胚内部。 4.注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液，注射时针头朝向注射点方向，每次注射停留4~6s。 5.封蜡：注射完毕，用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡。 6.培养：将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养。孵化箱温度设置33~35℃，湿度50%~70%，甲型流感病毒培养48~52小时，乙型流感病毒培养66~72小时。 需准备的仪器试剂： 手电筒，记号笔，碘酊，棉签，量筒（稀释），酒精灯，废液瓶，打孔器，三脚架，蜡块，连续注射器，一次性注射器，移液枪，移液枪枪头，镊子，纱布，打火机，蓝盖瓶。 注意事项： （1）、前一天将病毒原液拿至4℃冷库； （2）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服； （3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌； 收获尿囊液 鸡胚消毒: 将培养好的鸡胚放入4℃冷库进行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1~2分钟。接着，在鸡胚的气室用碘酊消毒。 烙蛋：将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋。 收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头，同时用5ml移液枪吸取尿囊液。收获的尿囊液应是澄清、微黄状。 保存：将收获的尿囊液放至6℃冷库保存。 需准备的仪器试剂： 新洁而灭溶液，碘酊，棉签，烙蛋器，废液瓶，镊子，5ml移液枪，5ml移液枪枪头，蓝盖瓶（数量由病毒原液体积决定）。 注意事项： （1）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服； （2）、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌； 血凝滴度试验 稀释病毒液：取一块洁净的“96”孔血凝板，横向摆放。用微量移液器（20—200ul）加入磷酸盐缓冲液100ul至第一孔，横向从第二孔开始，每孔均用微量移液器（5—50ul）加入磷酸盐缓冲液25ul直至第十二孔。 倍比稀释：在“U”型96孔血凝板的左侧标记样品名称，用微量移液器（5—50ul）从第一孔内加入25ul病毒悬浮液吹打混匀，将病毒液稀释五倍。取出25ul放到第二孔中，从第二孔开始倍比稀释，每孔吹打混匀，稀释到最后一孔弃掉25ul，此时的稀释倍数为1:10240。 阴性对照：在同一块“U”型96孔血凝板的最后一排，后三孔用25ul的磷酸盐缓冲液替代供试品，作为阴性对照。 加鸡血：将1%鸡红细胞悬液倒入加样槽吹打混匀，开始从第十二列至第一列每孔均用微量移液器（5-50μl）加入25μl的 1%鸡红细胞悬液，振荡均匀后置室温40分钟后观察结果。 5.结果计算：观察阴性对照，若红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，可见红细胞滑动呈泪滴状为“－”，则阴性对照成立。 按照《流感病毒血凝滴度检测标准操作规程》观察每孔凝集状态，结果以“++”（++以数字2代之）为终点，以红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为“++”亦即一个凝集单位，也就是说最高稀释度病毒能引起“++”号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度简称血凝滴度。 影响血凝抑制实验的因素 1?.红细胞悬液浓度：来源于不同个体鸡的红细胞，对抗原的敏感性不尽相同。因此实验时最好用3-4只未免疫鸡。配制红细胞时，红细胞浓度低，HI滴度就会下降；红细胞浓度高，HI滴度就会上升。有实验表明，红细胞浓度增加一倍，HI滴度就会上升20.7-0.9，因此，红细胞浓度以1％为宜。 2?.抗原的稀释倍数：配制抗原时，浓度必须准确。当抗原浓度高时，(HI)抗体效价就下降；当抗原浓度抵时，(HI)抗体效价就上升。 ?3?.实 验 用 的 稀 释 液（PBS）：?稀释液的pH值对实验有影响。稀释液的pH值5.8以下，红细胞容易产生自凝现象；pH值在7.8以上凝集图形易消失，也会造成实验误差。而pH值为7.0时，红细胞沉降