生化分离技术 学生作品 1银耳多糖的制备与鉴定.pptx

;;;银耳是我国传统的一种珍贵药用真菌。银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。银耳多糖具有明显提高机体免疫功能、抑制肿瘤转移、抗炎症、抗放射、抗血栓、降血糖等作用，是一种滋补强壮、扶正固本的保健食品和药物。 根据银耳原料的不同，银耳多糖常用的提取方法有热水浸提法、碱浸提法、酶法提取法和超声波辅助提取法等 4 种。 ;银耳多糖 （Tremella polysaccharides，TP） 是银耳中一种重要的生物活性物质，能够提高机体的免疫能???，并诱导干扰素的产生，经常食用银耳对预防癌症等多种疾病具有非常显著的效果。 银耳多糖在不同程度上对细胞因子 IL- 1α，IL- 6，IL- 8 的产生起到促进作用，且呈剂量依赖性。银耳多糖具有诱导单核细胞产生白介素 IL- 1，IL- 6 和肿瘤坏死因子的作用，而且多糖降解产物具有诱导单核细胞分泌IL- 1 或 IL- 6 的作用，所以银耳多糖对细胞因子的作用可能是通过各水解片段所共有的结构实现的。 银耳多糖通过对 IL- 2，IL- 6 和 TNF- α 的 mRNA 表达来促进这些细胞因子的生成银耳多糖是一种免疫增强剂，可以通过激活免疫细胞来提高机体的免疫功能。银耳多糖能够有效地激活淋巴细胞，提高淋巴细胞转化为 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的数量，增强淋巴细胞抵抗肿瘤细胞的能力，并且在服用多糖的期间机体的主要脏器不会受到一般药物副作用的损伤。尤其针对体内白细胞减少的症状。 ;;;;;1.银耳实体的处理步骤 （1）精确称取2.0g银耳两份 ①料液比1:60加水，20-25℃浸泡30min，研钵捣碎，制成浆液，调PH至6.3+复合酶2.25g，与50℃反应40min迅速升温至80℃灭酶，在60℃浸取1h ②高速研磨机粉碎2min，按料液比1：60加水室温浸泡30min，调PH至6.3+复合酶1.8g，与50℃反应40min迅速升温至80℃灭酶，在60℃浸取1h;（2） 离心。以转速 5 000 r/min 离心 5 min，取离心后银耳浸提液 4 mL，与 Sevage 试剂以 5∶1 的比例加入各离心管中，摇匀。以转速 4 000 r/min 离心10 min，除杂蛋白。 （3） 测吸光度度。取 2 mL 的浸提液置于相应的具塞试管中，每个具塞试管加入 6 mL 的硫酸蒽酮试液，沸水浴 10 min，然后冷水浴 15 min，作一空白对照 （2 mL 的蒸馏水加入 6 mL 的硫酸蒽酮试液）。用分光光度计在波长 620 nm 处测量其吸光度；记录6支样品溶液的吸光度值，以葡萄糖的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 试管1;试管2 比较数据显示综上所述，银耳的不同状态，相同浸提时间下浸提，并根据计算得到的银耳多糖质量浓度综合比较得知，其在浸泡前呈粉碎状态下以料比 1∶60 的加水比浸泡，于 60 ℃条件下浸提 1 h所得到的银耳多糖质量浓度最高，银耳多糖的浸提率也最高。;乙醇沉析 滤液加3倍量95%乙醇，搅拌均匀后，离心3000r/min 15min。沉淀用无水乙醇洗涤2次。乙醚洗涤1次，50℃以下真空干燥，得银耳多糖粗品，称重。 精制 取粗品1g，溶于100mL水中，溶解后离心除去不溶物。滤液加2%CTAB至沉淀完全。摇匀，精制2h,离心3000r/min 15min，沉淀用80℃热水洗涤3次，加100mL2moL/L氯化钠溶液于60℃解离4h,离心3000r/min 15min，沉淀用无水乙醇、乙醚洗涤，50℃以下真空干燥，得精制银耳多糖。 多糖鉴定 取上清液1mL，加入а-萘酚溶液2滴，摇匀，将试管倾斜，沿试管壁缓缓加入浓硫酸1.5mL，观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化。取2mL上清液加入2%CTAB溶液2~4滴，颜色变成紫色。 ;精密称取银耳20g，高速研磨机粉碎2min，按料液比1：60加水室温浸泡30min，调PH至6.3+复合酶1.8g，与50℃反应40min迅速升温至80℃灭酶，在60℃浸取1h。 离心。以转速 5 000 r/min 离心 5 min，取离心后银耳浸提液 4 mL，与 Sevage 试剂以 5∶1 的比例加入各离心管中，摇匀。以转速 4 000 r/min 离心10 min，除杂蛋白。 乙醇沉析 滤液加3倍量95%乙醇，搅拌均匀后，离心3000r/min 15min。沉淀用无水乙醇洗涤2次。乙醚洗涤1次，50℃以下真空干燥，得银耳多糖粗品，称重。 精制 取粗品1g，溶于100mL水中，溶解后离心除去不溶物。滤液加2%CTAB至沉淀完全。摇匀，精制2h,离心3000r/min 15min，沉淀用80℃热水洗涤3次，加100mL2moL/L氯化钠溶液于60℃解离4h,离心3000