UNG酶在PCR中的作用.pptxVIP

学 海 无 涯 UNG 酶在 PCR 中的作用 UNG 酶 Uracil-N-glycosylase 尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶 原理：UNG 酶的作用原理是选择性水解断裂含有 dU 的双链或单链 DNA 中的尿嘧啶糖 苷键，形成的有缺失硷基的 DNA 链在硷性介质，高温下会进一步水解断裂，从而被消除.UNG 酶的最佳活性温度为 50℃，95℃灭活。 作用：为保证 PCR 结果的准确性，要预防非特异性PCR 扩增和污染。常用的措施是使 用UNG 酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq 酶热启动。PCR 反应最常见，最重要的污染物是PCR 产物，防污染热启动 PCR 试剂盒以 dUTP 取代 dTTP，所以 PCR 产物都是含有 dU 的 DNA 链。在 PCR 开始前增加 50℃的保温步骤，UNG 酶即可将反应体系中已有的U-DNA 污染物 中的尿嘧啶硷基降解，并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂，消除由于污染 DNA 产生 的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时 UNG 酶被灭活，不会再降解新扩增的 产物U-DNA。 高品质的 UNG 酶可以消除高达 108 的 U-DNA 产物，和热启动 Taq 酶一同用于建立含 有 UNG/dUTP 防污染体系的热启动 PCR 反应系统。 UNG 酶特征 克隆有Ecoli K12 Uracil-N-Glycosylase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱 纯化分离出来的重组蛋白。分子量 25.66 KDa。 反应条件： 50 ℃ ，2 分钟；反应 buffer: 20mM Tris-HCl(PH:8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于 UV 照射的去污染作用对 500bp 以下的片段效果不好， 而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右，因此 UNG 的预防作用日益受到重视 和肯定。1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替 dT。这种 dU 化的 PCR 产物与 UNG 一 起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去 dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含 dU 的模板无任何影响。UNG 可从 单或双链 DNA 中消除尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP，使产物中掺入大量 dU。在再次进行 PCR 扩增前，用 UNG 处理 PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在 PCR 循环中的变性一步便可 被灭活，因此不会影响含 dU 的新的 PCR 产物。3. dU 引物法：合成引物时以 dU 代 dT，这 样 PCR 产物中仅 5ˊ端带 dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段 （1-2kb 以上）的扩增用 dUTP 法效率较用 dTTP 低，而用 dU 法就可克服这一缺点。dU 引 物最好将 dU 设计在 3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。4. 优点：可以去 除任何来源的污染；UNG 处理可以和 PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有 大量 dU 存在，可彻底消除污染源。5. 需注意的是掺入 dUTP 的DNA 不应对产物的任何操 作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化 UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则 转化产物会被受体菌 UNG 消化掉。 这个 原因太多了 假阳性 就是现在的 上海生工的产品 也有时会产生这样的情况， 原因很多 甚至包括 反应时 mg2+浓度，反应时间，退火温度..... 但从污染角度讲 主要有以下几种可能 1、污染原因;学 海 无 涯 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封 不严溢于容器外，或容器 外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中， 由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩 散，导 致彼此间的污染. (二)PCR 试剂的污染:主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR 核酸模板污染. (三)PCR 扩增产物污染.这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题.因为 PCR 产物拷 贝量大(一般为 1013 拷贝/ml)，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产 物污染，就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时