【课件-组织化学】_酶组织化学.pptVIP

酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂 采用无底物的孵育液 过固定或加热 激活剂 改变孵育液 选择PH值 细胞内的定位差异 对结果分析要考虑的问题 经过冻结和原位固定后，酶究竟能保存多少? 酶是否在原位? 反应酶起了多少作用？ 酶的活性是否代表了细胞生活时的状态? 沉淀的产物是否代表酶本身，时间延长是否会有改变，有没有扩散移位？ 常用酶显示反应 （1）同步显示法： 利用某些金属本身或化合物有颜色（金属离子沉淀反应） 硫化钴（黑色）硫化铅（棕黑色） （2） 二步显示法（孵育后法） 酶与底物作用产生的底物沉积于原位，随后显色反应、 适用于：PH反应差别大；底物易分解 缺点：要求PRP 弥散度低 （3）底物自身显示法 酶促底物生成不溶的有色物质。 金属离子沉积法--Gomori（1941年） 以beta-甘油磷酸钠为底物，在酸性PH值(4.4-5.5)下，被酸性磷酸酶（ACP）水解，释放出磷酸盐。遇铅离子（硝酸铅或者醋酸铅）生成磷酸铅沉淀，再被S2-置换，最终生成硫化铅棕色沉淀。 酶促反应 R-PO4Na2+H20 R-OH +Pb3(PO4) 2 显色反应 Pb3(PO4)2 + 3 S2- 3PbS （棕黑色沉淀） 该方法金属离子 容易反应，沉着颗粒微细，反应色调美丽，反差明显 。 ACP Pb 2+ 激活剂：Mn2+ 抑制剂：NaF 定位：溶酶体，ER， 胞液 该酶活性比较高的器官：肝、肾、肠、脾、肾上腺 注意事项: 铅离子 浓度是关键： 非特异性吸附 NaF处理排除假阳性 孵育时间不宜过长：弥散及核非特异着色 铅法适用于: ACP 5’-核苷酸酶 G6P酶 膜ATPase 线粒体ATPase TTPase(硫氨酸焦磷酸酶） （2）偶氮盐偶联反应（同步显示法） 人工合成的酶底物在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，使其生成不溶性的偶氮色素而证明酶的存在。 碱性磷酸酶 a-萘基磷酸钠 磷酸氢二钠 + a -萘酚 α-萘酚 + Fast Blue 偶氮染料 （蓝色沉淀） 酯酶、转肽酶、肽酶 酶+水 重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样（蓝色，紫色，红色，褐色等） 常用底物： 萘酚AS-B1 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR 常用重氮盐 坚牢兰RR 坚牢兰B 坚牢兰RC 坚牢兰TR 坚牢兰B 六偶氮副品红 六偶氮新品红 应用：ALPase, ACPase 酯酶， 转肽酶，肽酶， beta-葡糖苷酶 方法：同时偶联法 后偶联法：防止重氮盐对酶的抑制作用 3. 四唑反应 底物+ 四唑盐 氢离子与无色四唑盐结合 常用四唑盐种类 三苯四唑氯化物TTC 蓝四唑盐 BT 新四唑盐 NT 硝基兰四唑盐(nitroblue tetrazolium, NBT) 四硝基兰四唑TNBT 噻唑兰 (3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL) 2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 红色或蓝色沉淀 脱氢酶/氧化酶 被还原 四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶 单胺氧化酶和几乎所有的脱氢酶都可以用四唑反应显示 以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（NBT）为受氢体，还原为紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性 琥珀酸脱氢酶是线粒体的标记酶之一 存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌，肾曲管上皮，肝细胞含量最丰富 4. 联苯胺色素法 过氧化物酶（联苯胺法） NH2 NH2 酶 + H2O2 NH NH 棕 色沉淀 2H 联苯胺 联苯胺蓝 * 根据国际酶学会议于1961年提出的分类法，按催化反应的性质把酶分为六类。 * Klebs(1868)和H. Stuve1872)用愈创木酯酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化物酶的存在； P.Ehrlich(1885) 发现了细胞色素氧化酶； * 早在1868年由Klebs及Struve（1872）首先证明在中性多性核白细胞中有过氧化酶存在。据Dixon和Vebb1958年记载，酶的数目超过了800种，其中仅少数能以组织化学方法证明。1953年只有18种技术可用于显示组织切片中酶的分布，现已有100种以上。 20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的