免疫组化实验方法[学习].pptVIP

染色的基本程序 ①标记抗体与标本中抗原反应结合； ②用缓冲液洗去未结合的成分； ③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。 * 方法汇编·实用借鉴 反应条件 抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件： （1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成 （2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成 （3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.1～1%） （4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白 （5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇 * 方法汇编·实用借鉴 荧光素 1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。最常用。 2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。 3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～600nm，呈橙红色荧光。价廉。 * 方法汇编·实用借鉴 染色注意事项 （1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。 （2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右） （3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。 （4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。 （5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。 （6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。 * 方法汇编·实用借鉴 酶标抗体法 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。 * 方法汇编·实用借鉴 抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC) 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用： ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广 ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染 * 方法汇编·实用借鉴 * 方法汇编·实用借鉴 ABC法的特点： 敏感性强 特异性强，背景染色淡 方法简便，节约时间 可用于双重或多重免疫染色。 * 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用借鉴 方法汇编·实用